59株大腸桿菌中整合子的研究

陸思靜，管希周，王睿，梁志欣，劉又寧（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科，錦州市 11001；.解放軍總醫(yī)院軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京市 100853）

59株大腸桿菌中整合子的研究

陸思靜1＊，管希周2，王睿2，梁志欣2，劉又寧2（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科，錦州市 121001；2.解放軍總醫(yī)院軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京市 100853）

目的：研究59株耐頭孢西丁大腸桿菌整合子的分類、結(jié)構(gòu)及其在介導(dǎo)耐藥中的作用。方法：利用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測(cè)整合酶基因（intI），對(duì)其陽(yáng)性菌株可變區(qū)（Int）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析；采用微量稀釋法測(cè)定22種抗生素對(duì)試驗(yàn)菌株的敏感性。結(jié)果：59株大腸桿菌中，45株Ⅰ類整合酶基因陽(yáng)性（76%）；所攜帶的耐藥基因盒絕大多數(shù)為aadA5和dfr 17；僅有2株攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因盒；整合子陽(yáng)性組抑菌濃度明顯高于陰性組。結(jié)論：Ⅰ類整合子廣泛地存在于耐頭孢西丁大腸桿菌中；耐藥基因盒是整合子陽(yáng)性菌株對(duì)氨基糖苷類、磺胺類藥物及氯霉素耐藥的主要原因，但對(duì)介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類耐藥方面，不起主要作用。

整合子；基因盒；細(xì)菌耐藥；聚合酶鏈反應(yīng)

大腸桿菌是引起下呼吸道感染最常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌之一[1]，隨著多重耐藥菌株的日漸增多，治療該菌引起的感染變得越來(lái)越困難。其耐藥機(jī)制非常復(fù)雜。研究表明，整合子不僅可介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性群聚，導(dǎo)致多重耐藥性的產(chǎn)生，而且可以在不同遺傳物質(zhì)和菌種間轉(zhuǎn)移，引起耐藥基因高效快速轉(zhuǎn)移，這已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[2]。但國(guó)內(nèi)這方面的研究鮮見(jiàn)。整合子由5′-和3′-保守末端及中間的可變序列組成，5′-保守末端攜帶編碼整合酶的基因（intI）、整合酶基因重組位點(diǎn)（attI）和一個(gè)啟動(dòng)子的基因片段。中間的可變區(qū)域攜帶有耐藥基因的基因盒[3]?，F(xiàn)已確認(rèn)至少有9種整合子，但在耐藥方面起最主要作用的為第1類整合子[4，5]。以解放軍總醫(yī)院臨床連續(xù)收集的59株大腸桿菌為對(duì)象，對(duì)其耐藥情況、整合子分布及其結(jié)構(gòu)特征、整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制在多重耐藥性中的作用進(jìn)行研究，為指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素，控制耐藥菌株在院內(nèi)的傳播提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

解放軍總醫(yī)院微生物科從2001～2002年各種臨床標(biāo)本中分離得到的全部大腸桿菌719株。紙片瓊脂擴(kuò)散藥敏試驗(yàn)篩選出對(duì)頭孢西丁耐藥菌株59株[6]。

1.2 主要試劑與儀器

DL15 000 DNA Marker為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；pGEM-T載體、DNA聚合酶采用美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；包被22種抗生素的96孔藥敏板（天津金章醫(yī)用新技術(shù)研究所）；DNA Thermal Cycler 2400為美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)品。

1.3 藥敏試驗(yàn)方法

采用微量稀釋法測(cè)定頭孢西丁耐藥的59株大腸桿菌對(duì)以下22種抗生素的最低抑菌濃度（MIC）：磺胺甲基異唑、萘啶酸、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、利福平、氯霉素、四環(huán)素、亞胺培南、環(huán)丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS 2004年版[7]的規(guī)定執(zhí)行。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)將中敏歸于耐藥分析。

1.4 整合酶基因的PCR檢測(cè)

引物序列為IntIF：5′-TGC GGG TYA ARG ATB TKG ATT-3′，IntIB：5′-CAR CAC ATG CGT RTA RAT-3′，目的片段長(zhǎng)度491 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃1 min，51℃30 s，72℃45 s，循環(huán)40次，最后72℃延伸10 min，在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳中的分析結(jié)果，出現(xiàn)明顯亮帶的為初篩陽(yáng)性。陽(yáng)性條帶行切膠純化后分別用內(nèi)切酶（HinfⅠ、AVaⅡ）行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，選取酶切片段長(zhǎng)度一致的PCR純化產(chǎn)物測(cè)序，用Blast程序分析。

1.5 可變區(qū)基因盒PCR檢測(cè)及DNA測(cè)序分析

引物序列為Int-F：CGG ATG AAG GCA GCA ACC CA，Int-R：AAG CAG ACT TGA CCT GAT AG。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸7 min，4℃保護(hù)。在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳中的分析結(jié)果，陽(yáng)性條帶行切膠純化，TA克隆，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司及上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，在Genbank比對(duì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)整合子檢測(cè)結(jié)果，將大腸桿菌分為整合子陽(yáng)性組和陰性組。采用SPSS 11.52統(tǒng)計(jì)軟件和χ2檢驗(yàn)對(duì)整合子陽(yáng)性組和陰性組菌株的藥敏情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌中整合酶基因PCR檢測(cè)及酶切測(cè)序結(jié)果

頭孢西丁耐藥的59株大腸桿菌中，45株均在500 bp左右出現(xiàn)了陽(yáng)性條帶，提示上述菌株攜帶了整合酶基因，陽(yáng)性率為76%（45/59），結(jié)果見(jiàn)圖1。整合酶基因PCR純化產(chǎn)物的酶切及序列分析：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HinfⅠ酶切后進(jìn)行電泳檢測(cè)的結(jié)果是44個(gè)PCR產(chǎn)物均沒(méi)有被消化，得到491 bp片段，整合酶基因PCR產(chǎn)物HinfⅠ酶切結(jié)果見(jiàn)圖2。PCR產(chǎn)物未被切開(kāi)，且保留原有的片段，證明這些菌株攜帶Ⅰ類整合子。用AvaⅡ?qū)ι鲜龅腜CR產(chǎn)物酶切，在146 bp和345 bp產(chǎn)生2個(gè)酶切片段，進(jìn)一步證實(shí)為Ⅰ類整合子，整合酶基因PCR產(chǎn)物AvaⅡ酶切結(jié)果見(jiàn)圖3。隨機(jī)抽取的2個(gè)樣品ECO03、ECO34測(cè)序，結(jié)果在Genbank上Blast為Ⅰ類整合酶。與AY463797比較序列符合率（identities）為100%。

圖1 整合酶基因PCR結(jié)果電泳圖M.2 000 bp DNAMarker；1～7均為實(shí)驗(yàn)菌株Fig 1 Electrophoretogram of PCR product of intIM.2 000 bp DNAMarker；1～7.strains

圖2 整合酶基因PCR產(chǎn)物HinfⅠ酶切結(jié)果電泳圖M.2 000 bp DNAMarker；1～8均為實(shí)驗(yàn)菌株Fig 2Electrophoretogram of intI PCR product digested with HinfⅠM.2 000 bp DNAMarker；1～8.strains

圖3 整合酶基因PCR產(chǎn)物AvaⅡ酶切結(jié)果電泳圖M.2 000 bp DNAMarker；1～10均為實(shí)驗(yàn)菌株Fig 3 Electrophoretogram of intI PCR product digested withAvaⅡM.2 000 bp DNAMarker；1～10.strains

2.2 Ⅰ類整合子可變區(qū)相關(guān)基因盒擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)45株Ⅰ類整合陽(yáng)性菌株用可變區(qū)基因盒特異引物，擴(kuò)增出的42個(gè)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，根據(jù)片段大小分成3組：36株出現(xiàn)接近1 700 bp大小條帶的為A組，切膠純化后，用DraI和EcoRV雙酶切，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析證實(shí)為同樣片段；2株出現(xiàn)接近2 000 bp大小條帶的為B組；2株出現(xiàn)接近2 500 bp條帶為C組；2株出現(xiàn)大于2 500 bp條帶為D組。整合子可變區(qū)特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。在A組中隨機(jī)抽取4個(gè)，B、C、D組各2株分別進(jìn)行測(cè)序和序列分析。A組片段大小為1 664 bp，其含有2個(gè)開(kāi)放閱讀框，大小分別為474 bp和789 bp，與耐藥基因盒aadA5和dfr17都為100%同源，分別對(duì)氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素和磺胺類藥物甲氧芐啶產(chǎn)生耐藥，這4株所帶基因盒完全一致，Genbank登陸號(hào)分別為AY748452和AY828551。B組PCR產(chǎn)物測(cè)序表明，其長(zhǎng)度為1 913 bp，內(nèi)部插入dhfrⅫ基因（編碼二氫葉酸還原酶，對(duì)磺胺類耐藥）和aadA2基因（編碼氨基酰腺苷?；D(zhuǎn)移酶，對(duì)氨基糖苷類耐藥），序列符合率為100%，還有一編碼功能不清楚的ORF5，Genbank登陸號(hào)AY748453。C組PCR產(chǎn)物測(cè)序表明，其長(zhǎng)度為2 360 bp，經(jīng)Blast比對(duì)在整合子可變區(qū)共有2個(gè)耐藥基因盒：包括1個(gè)aacA4，產(chǎn)生氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC（6′）-Ib（對(duì)壯觀霉素、鏈霉素耐藥）和cmlA1-variant基因（對(duì)氯霉素耐藥）。與AB212941比較序列符合率為99%，有6個(gè)堿基的變異，不在讀碼框內(nèi)為無(wú)意義突變，Genbank登陸號(hào)為AY912492。D組PCR產(chǎn)物經(jīng)多次測(cè)序失敗，ECO16用整合酶基因的前向兼并引物和TEM擴(kuò)出的片段長(zhǎng)度為1 467 bp，帶有blaTEM-1b基因，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，與tnpR基因相接，Genbank登陸號(hào)為DQ406736。另一株擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度約為3 000 bp的ECO24，測(cè)序一端為Ⅰ類整合酶基因，另一端為blaTEM-1b基因，中間部分未能測(cè)通，仍在研究中。

圖4 整合子可變區(qū)特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖M.15 000 bp DNA Marker；1～2為A組；3～4為B組；5～6為C組；7～8為D組Fig 4 Electrophoretogram for PCR product of specific primer in variable regions of integronsM.15 000 bp DNA Marker；1～2.group A；3～4.group B；5～6.group C；7～8.group D

2.3 整合子陽(yáng)性菌株與陰性菌株耐藥情況比較

對(duì)59株菌按整合子陰、陽(yáng)性分為2組，對(duì)22種抗生素的MIC用多因素的方差分析顯示，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.01），整合子陰性組抑菌濃度明顯低于陽(yáng)性組，見(jiàn)圖5。對(duì)22種抗生素的MIC用單因素t檢驗(yàn)，分析顯示：在整合子陰性組，磺胺甲基異唑（SMZ）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、阿米卡星（AMK）、奈替米星（NET）、利福平（RIF）、氯霉素（CHL）、四環(huán)素（TET）抑菌濃度明顯低于陽(yáng)性組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；亞胺培南、環(huán)丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢哌酮、替卡西林的抑菌濃度與整合子陽(yáng)性組抑菌濃度相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

圖5 整合子陽(yáng)性菌株與陰性菌株耐藥情況比較與整合子陰性組比較：*P＜0.05Fig 5 Comparison of drug resistance between integron-positive strains and the negative strains vs.integron-negative group：*P＜0.05

在研究中，我們以第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因的簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增整合酶基因作為整合子陽(yáng)性菌株的篩選。實(shí)驗(yàn)顯示，整合子檢出率76%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他國(guó)家或地區(qū)的平均水平50%左右[8]，可能因?yàn)椋海?）實(shí)驗(yàn)樣本均為分離自患者的藥敏測(cè)試中具有多重耐藥表型的高耐藥菌；（2）由于有的第Ⅰ類整合子具有不完整的3′-保守端[9]，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，簡(jiǎn)并引物可同時(shí)檢測(cè)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的分布，可防止以3′-保守端擴(kuò)增結(jié)果作為整合子陽(yáng)性菌株的檢出方法所造成漏檢。45株整合酶基因陽(yáng)性片段經(jīng)測(cè)序和酶切證實(shí)均為Ⅰ類整合子，與一些報(bào)道[10]一致。

研究表明，整合子陽(yáng)性組抑菌濃度明顯高于陰性組，主要在磺胺類藥物、四環(huán)素、氯霉素及氨基糖苷類，而2組其它藥物比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：整合子所攜帶與耐藥基因盒主要是aadA5和dfr17，aacA4和cmlA1，分別對(duì)氨基糖苷類抗生素壯觀霉素、鏈霉素、磺胺類藥物甲氧芐啶及氯霉素耐藥。說(shuō)明整合子攜帶的耐藥基因盒是整合子陽(yáng)性菌株對(duì)氨基糖苷類、磺胺類藥物及氯霉素耐藥的主要原因。國(guó)外許多研究也發(fā)現(xiàn)編碼對(duì)鏈霉素、壯觀霉素和甲氧芐啶的耐藥性的基因盒常見(jiàn)，但是最常見(jiàn)的是dhfr1-aadA1基因盒組合[11]。

盡管有大量報(bào)道β-內(nèi)酰胺類基因盒是整合子最常攜帶的基因盒之一，但本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)2株細(xì)菌整合子攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因盒，與報(bào)道[12]不一致。提示，在本研究的59株大腸桿菌中，耐藥基因盒在介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥方面，不起主要作用。值得注意的是，整合子中已經(jīng)攜帶有β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因盒，盡管很少，也應(yīng)引起足夠重視。因?yàn)榧?xì)菌自身染色體上的整合子-耐藥基因盒可通過(guò)復(fù)制傳遞給下一代，即垂直傳播，而整合在質(zhì)粒上的則可在同菌屬甚至不同菌屬間水平傳播。

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Study on Integron in 59 Strains of Escherichia Coli

LU Si-jing（Dept.of Respiratory，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）
GUAN Xi-zhou，WANG Rui，LIANG Zhi-xin，LIU You-ning（Chinese PLA Postgraduate Medical School，Beijing 100853，China）

OBJECTIVE：To investigate the classification，structure and inducing drug resistance of integron in 59 strains of cefoxitin-resistantEscherichia coli.METHODS：PCR method was used to detect integrase gene（intI）and product of variable region of positive strain was performed on sequencing.Sensitiveness of experimental strains to 22 kinds of antibiotics was detected with microdilution method.RESULTS：IntI1 was identified in 45 strains（76%）of the 59 strainsEscherichia coli.The most drug resistance genes cassettes were aadA5 and dfr17，only 2 strains encoding β-lactamase drug resistance gene cassettes.The MIC of integron positive groups was statistically significantly higher than negative groups.CONCLUSION：Class 1 integron resided in cefoxitin-resistantEscherichia coliwidely.The cause of drug resistance of integron positive strain to aminoglycosides，sulfonamides and chloramphenicol is drug resistance gene cassettes.Gene cassettes does not play important role in integron-mediated drug resistance.

Integron；Gene cassettes；Drug resistance；PCR

R378.2+1；R969.3

A

1001-0408（2010）10-0901-04

2009-12-06

2010-01-24）