副溶血弧菌中具有Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能的MgtE基因的分子克隆與功能鑒定

李來(lái)梅 ，于 峰 ，2 ，靳 磊

（1.湖南省微生物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410009；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081）

Mg2+具有獨(dú)特的幾何特性和化學(xué)特性，研究人員推測(cè)其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也具有獨(dú)特性[1]。目前，整個(gè)生物界中已發(fā)現(xiàn)有五大Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)家族:CorA家族，Mg2+/H+交換體，離子通道，P型磷酸酶和MgtE基因家族[2]。主要的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)家族是細(xì)菌中的CorA家族，蛋白拓?fù)浞治鲲@示其具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)：N端有一個(gè)酸性的周質(zhì)區(qū)，C端有2個(gè)疏水的跨膜區(qū)，有很強(qiáng)的螺旋性。CorA序列上存在保守基序GMN，是其轉(zhuǎn)運(yùn)Mg2+所必需的，若GMN基序中有一個(gè)氨基酸突變，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力就會(huì)喪失[3]。

MgtE基因家族首先在Bacillus firmus OF4中被Ronald等人在尋找新的CorA基因時(shí)發(fā)現(xiàn)。目前一般認(rèn)為其具有五個(gè)跨膜區(qū)。其跨膜區(qū)的分布和CorA具相似性，都主要分布于C端，其N(xiāo)端位于胞質(zhì)區(qū)。MgtE和CorA兩基因家族在轉(zhuǎn)運(yùn)離子的類別上也具有部分相似性。MgtE的突變株和CorA一樣可增強(qiáng)對(duì)Co2+的抗性。MgtE可功能互補(bǔ)缺失CorA，MgtA，MgtB Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的沙門(mén)氏桿菌突變株MM281，使其可在低濃度 Mg2+濃度（<10 mM）下生長(zhǎng)。同時(shí)MgtE 也具有Co2+，Cd2+，Mn2+等二價(jià)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。多序列比對(duì)表明其第二和第五個(gè)跨膜區(qū)較保守?；蚪M序列搜索顯示MgtE家族在古細(xì)菌，原核生物和真核生物中都有分布，但其分布的廣泛性不如CorA家族。目前對(duì)MgtE基因家族轉(zhuǎn)運(yùn)Mg2+的分子機(jī)制還了解甚少。為了更進(jìn)一步了解MgtE基因家族轉(zhuǎn)運(yùn)Mg2+的分子機(jī)制，筆者從副溶血弧菌中克隆了其MgtE基因，將之稱為VP-MgtE，并對(duì)其進(jìn)行了功能鑒定和定點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 E.coli DH5α 在37℃，LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，必要時(shí)添加相應(yīng)抗生素。副溶血弧菌于37℃，LB中培養(yǎng)。S.typhimurium MM281需要高濃度Mg2+才可以生長(zhǎng)，它被用于功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，于37℃，Mg2+（以MgSO4的形式添加）終濃度為100 mM，氯霉素濃度為34μg/mL的LB或N-minimal培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

1.1.2 試 劑 2pMD18-T載體和所有酶類均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。質(zhì)粒純化及膠回收試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙安比奧生物技術(shù)公司。pTrc-99A由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 VP-MgtE基因的克隆及載體構(gòu)建 VP基因組DNA按照Flamm[4]的方法提取。根據(jù)VP-MgtE基因序列用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并添加酶切位點(diǎn)SacⅠ和KpnⅠ。正向引物為［TATGAGCTCGAACGAATGGCAG（SacⅠ）］反向引物為［ATAGGTACCACTGGCTTAGATCAGC（KpnⅠ）］。用高保真酶Pyrobest DNA polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥漳康钠?，連接到pMD18-T載體上，再用SacⅠ和KpnⅠ酶切，定向克隆至表達(dá)載體pTrc99A，并酶切鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.2 生物信息學(xué)分析的主要軟件及數(shù)據(jù)庫(kù) 基因序列數(shù)據(jù)由NCBI中獲得?？缒^(qū)分析軟件為T(mén)MHMM，多序列比對(duì)軟件為ClustalW，常規(guī)的核酸蛋白分析軟件利用DNAMAN進(jìn)行。

1.2.3 MM281的功能互補(bǔ)和鋁離子毒害實(shí)驗(yàn) 將pTrc99A-VP-MgtE質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入MM281。鑒定陽(yáng)性克隆，分別挑取MM281-VP-MgtE，MM281-pTrc，MM281單菌落在試管中過(guò)夜培養(yǎng)。然后再按50∶1（LB∶菌液＝50 mL∶1 m）的比例接種于含有相應(yīng)抗生素的錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。同時(shí)測(cè)值。當(dāng)達(dá)到0.6～0.7之間時(shí)，加入1mM/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，當(dāng)?shù)竭_(dá)1.0時(shí)取出，取菌液100μL加入 900 μL 水中。分別稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五個(gè)梯度。取稀釋的菌液2μL點(diǎn)樣于不同Mg2+濃度的互補(bǔ)平板上，Al3+（以AlCl3的形式添加）毒害中點(diǎn)樣于pH 5，Mg2+濃度為100 mM的LB固體培養(yǎng)基上。37℃倒置培養(yǎng)2 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況并拍照。

1.2.4 液體生長(zhǎng)曲線 挑取MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-pTrc的單菌落在含相應(yīng)抗生素的LB中搖菌，當(dāng)OD600=0.6～0.8時(shí)，1 200 rpm離心收集細(xì)胞，用去離子水清洗兩遍，以除去殘留的Mg2+，然后用去離子懸浮。準(zhǔn)備7種不同濃度（0μM，50μM，100μM，500μM，1 mM，5 mM，10 mM）和相應(yīng)抗生素的N-minimal培養(yǎng)基，將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物（起始=0.001～0.002）加入N-minimal培養(yǎng)基中。37℃搖菌，每2 h測(cè)一次并記錄數(shù)據(jù)。共測(cè)24 h。

1.2.5 離子敏感性實(shí)驗(yàn) 按功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)過(guò)程一樣準(zhǔn)備好菌液，然后點(diǎn)至不同濃度的金屬離子板上。37℃倒置培養(yǎng)2 d后觀察其生長(zhǎng)情況并拍照。

1.2.6 定點(diǎn)突變 定點(diǎn)突變的方法按照分子克隆上介紹的重疊延伸誘變的方法分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。從野生型VP-MgtE-pTrc99A中用高保真酶Pyrobest DNA polymerase進(jìn)行三次PCR。再SacⅠ，KpnⅠ雙酶切，定向構(gòu)建至pTrc-99A上產(chǎn)生特異位點(diǎn)的突變。突變引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。再按照1.2.3的方法進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。

表1 突變引物設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與討論

2.1 VP-MgtE與MgtE基因家族其它成員相比顯示部分序列相似性

VP-MgtE的編碼一個(gè)含451個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)?？缒し治鲲@示其具有五個(gè)跨膜區(qū)。其與Bacillus firmus OF4和Providencia stuartii中的MgtE序列分別具有21.15%，14.69%的相似性。多序列比對(duì)表明它們?cè)诘诙偷谖鍌€(gè)跨膜區(qū)具有較高的相似性（見(jiàn)圖1）。

圖1 VP－MgtE與MgtE家族其他基因clustalw比對(duì)圖

圖1 為VP-MgtE和MgtE家族其他成員運(yùn)用ClustalW的比對(duì)結(jié)果。TM2，TM5方框標(biāo)示處的A、G、D、G位點(diǎn)表示突變后對(duì)其功能影響很大者，TM4，TM5方框標(biāo)示處的D、L位點(diǎn)表示對(duì)其功能影響較少者，TM4方框標(biāo)示處的P位點(diǎn)表示無(wú)影響。圖中標(biāo)出的五個(gè)跨膜區(qū)（TM1-TM5）為根據(jù)VPMgtE的蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)所得到。比對(duì)中其他基因 GenBank登陸號(hào)分別為 B.firmus：U18744；P.stuartii：U23806；Human；NM_173854。

2.2 VP-MgtE可功能互補(bǔ)MM281的生長(zhǎng)

MM281是一類喪失了 CorA，MgtA，MgtB Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的沙門(mén)氏桿菌突變株。它只能在高濃度Mg2+（>100 mM）下達(dá)到最佳生長(zhǎng)速度。結(jié)合功能互補(bǔ)的方法，它可作為一個(gè)研究Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)的很好的系統(tǒng)。表達(dá)了VP-MgtE的MM281重組菌株可在低濃度Mg2+情況下生長(zhǎng)，甚至在不加Mg2+的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而其陰性對(duì)照MM281，pTrc99A-MM281則只能在大于10 mM的N-minimal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（見(jiàn)圖2）。結(jié)果說(shuō)明，VP-MgtE的表達(dá)互補(bǔ)了MM281在Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)上的功能缺失，使之重新具有了Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力。從而使其可在含低濃度（<10mM）Mg2+的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線結(jié)果也再次證明了目的基因的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。由圖3、圖4可知，表達(dá)了目的基因的MM281轉(zhuǎn)化子可在 100μM的N-minimal培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。而陰性對(duì)照只能在10 mM的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

圖2 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在不同Mg2+濃度的N-minimal互補(bǔ)平板上的生長(zhǎng)結(jié)果

圖3 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE 在 10 mM Mg2+的N-minimal培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)結(jié)果

圖4 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE 在 100 μM Mg2+的N-minimal培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)結(jié)果現(xiàn)差別

2.3 VP-MgtE的表達(dá)改變了MM281的離子敏感性

已有研究顯示，當(dāng)細(xì)菌中積累一定量的重金屬離子（如 Co2+，Cd2+，Mn2+，Zn2+）時(shí)，就會(huì)對(duì)細(xì)菌本身產(chǎn)生毒害作用并使之死亡。由圖5可知，表達(dá)了VP-MgtE基因的轉(zhuǎn)化子增加了對(duì)Ni2+，Co2+，Mn2+，Cu2+的敏感性，當(dāng) Ni2+，Co2+，Mn2+，Cu2+離子濃度分別達(dá)到500μM，500μM，500μM，1 mM 時(shí)，表達(dá)了目的基因的菌株就會(huì)死亡?？梢哉J(rèn)為VP-MgtE有Co2+，Cd2+，Mn2+，Zn2+，Ni2+，F(xiàn)e2+，Cu2+離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

2.4 VP-MgtE的表達(dá)提高了MM281對(duì)鋁毒害的抗性

研究表明當(dāng)pH<6時(shí)鋁離子就可從結(jié)合態(tài)釋放出來(lái)產(chǎn)生毒害作用。在pH=5時(shí)研究了VP-MgtE的鋁抗性，結(jié)果表明VP-MgtE的表達(dá)可提高M(jìn)M281對(duì)鋁毒害的抗性（見(jiàn)圖6）。為了證實(shí)確實(shí)是Al3+而不是Cl-在起毒害作用，同時(shí)做了KCl的實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)沒(méi)有區(qū)別。

2.5 定點(diǎn)突變改變了VP-MgtE的Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力

圖5 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在含有不同金屬離子濃度的N-minimal固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

圖6 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-MgtE在含不同鋁離子濃度的LB平板上的互補(bǔ)結(jié)果

運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法對(duì)VP-MgtE蛋白中的7個(gè)氨基酸進(jìn)行了突變，由圖7可以發(fā)現(xiàn)，VP-J1，VP-J2，VP-J5，VP-J6 的突變使目的蛋白的 Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力有很大的降底，VP-J4的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和目的蛋白相比，有輕微的降底，VP-J3，VP-J7出乎實(shí)驗(yàn)預(yù)期，在10μM情況下和目的蛋白相比這兩個(gè)突變株的轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯提高。這些突變都集中在第2和第5跨膜區(qū)。在這兩個(gè)跨膜區(qū)的每個(gè)突變對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)能力都有影響，這也說(shuō)明了這兩個(gè)跨膜區(qū)在Mg2+裝運(yùn)中的重要性。

圖7 定點(diǎn)突變結(jié)果

3 討論

序列分析顯示VP-MgtE的蛋白序列與目前已知的MgtE家族成員顯示了部分相似性，多序列比對(duì)表明，它們?cè)诘?和第5個(gè)跨膜區(qū)和其它成員有較高的相似性。在一些特定的保守基序中MgtE家族成員具有完全的相似性，如第5個(gè)跨膜區(qū)的DP基序。實(shí)驗(yàn)運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法研究了這些保守區(qū)域，結(jié)果顯示，當(dāng)這兩個(gè)跨膜區(qū)中的一些保守氨基酸突變以后，它的鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力和野生型相比有明顯下降，甚至是完全喪失。同時(shí)本課題組還從不同的菌種克隆了3個(gè)MgtE家族成員并進(jìn)行了功能鑒定，它們?cè)谶@些保守的基序中也是完全一致的。由此可見(jiàn)，這些保守的氨基酸是MgtE家族發(fā)揮Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能所必需的。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明VP-MgtE轉(zhuǎn)運(yùn)Mg2+不受pH值的影響。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)VP-MgtE在高濃度的Mg2+下的生長(zhǎng)反而不如在低濃度的情況下生長(zhǎng)的快，因此猜測(cè)VP-MgtE可能為一類高親和性，轉(zhuǎn)運(yùn)鎂離子的載體蛋白。

[1]Gibson M M，Bagga，Maguire M E.Magnesium transport in Salmo nella yphimurium:The influence of new mutation conferring Co2+resistance on the CorA Mg2+transporter system[J].Mol.Microbiol，1991，（5）：2753－2762.

[2]Richard CG.Genes for magnesium transport[J].Current Opinion，2003，（6）：263-267.

[3]Li L，Ana F T，Revel S M，et al.A Novel Family of Magnesium Transport Genes in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2001，（13）：2761-2775.

[4]Flamm R K，Hinrichs D J，Thomashow M F.Introduction of pAM beta 1 into Listeria monocytogenes by conjugation and homology between native L[J].monocytogenes plasmids，1984，44：157-161.