一種新的微衛(wèi)星PAGE的DNA顯帶方法

劉夢(mèng)培，田 敏，傅大立，傅建敏，王彩霞

（1.中國(guó)林科院經(jīng)濟(jì)林研究開(kāi)發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.中國(guó)林科院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽(yáng) 311400）

微衛(wèi)星DNA又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR)，是由1～6個(gè)堿基多次串聯(lián)重復(fù)組成的核苷酸序列，在基因組間廣泛分布，具有共顯性、重復(fù)性好、多態(tài)性高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、檢測(cè)手段簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)[1]，已成功應(yīng)用在物種的遺傳多樣性（genetic diversity）[2－3]、遺傳圖譜構(gòu)建（genetic mapping）[4－5]、系譜分析（Pedigree analysis）[6－7]、遺傳育種（Genetics and Breeding）[8－9]等方面。

微衛(wèi)星DNA條帶的鑒別常采用聚丙烯酰胺凝 膠 電 泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）銀染法，PAGE由Raymends和Weintraub在1959年創(chuàng)建，具有不易擴(kuò)散、靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[10]。銀染技術(shù)是其常用的顯影方法，如Bassam銀染法[11]、Sanguinetti銀染法以及在其基礎(chǔ)上改良的一系列銀染法。銀染法的缺陷是步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、背景模糊、條帶不清等，極易造成DNA條帶錯(cuò)判，從而產(chǎn)生分析誤差。許多研究者針對(duì)這些問(wèn)題做了大量研究，但不能從根本上解決問(wèn)題。本研究提出了微衛(wèi)星PAGE的熒光染料顯影法，試圖從一個(gè)新的思路解決PAGE顯帶的問(wèn)題。

1 材料和方法

1.1 材料

杏屬不同品種幼嫩葉片；SSR引物UDP98-405，正向引物序列：5′-ACGTGATGAACTGACACCCA-3′，反向引物序列：5′-CCTACCGTCTCGTTTCT GAG-3′；GelRed核酸熒光染料。

1.2 PCR反應(yīng)體系和程序

PCR反應(yīng)體系總體積20μL，其中10×PCR Buffer 2.0μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、10 mmol/L dNTPs MiX 0.4μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL、10μmol/L的上下游引物各0.5μL、DNA模板0.5μL、ddH2O 14.6μL。PCR反 應(yīng) 在Bio-Rad C1000T M Thermal Cycler型號(hào)的擴(kuò)增儀上進(jìn)行。ISSR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。試驗(yàn)于中國(guó)林科院亞熱帶林業(yè)研究所植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳顯帶

PCR產(chǎn)物在濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠上分離；核酸熒光染料為GelRed，采用前染的方法，將GelRed核酸熒光染料加到溴酚藍(lán)上樣緩沖液中。將4μL PCR產(chǎn)物與2μL含有g(shù)elred的溴酚藍(lán)上樣緩沖液在PCR管中混合均勻，取3μL上樣，80 V電壓下電泳1.5 h。

電泳結(jié)束后，將凝膠直接放入上海產(chǎn)FR-200A型全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置中進(jìn)行拍照和分析。

1.4 改良的微衛(wèi)星PAGE凝膠銀染法顯帶

PCR產(chǎn)物在8%（29∶1）聚丙烯酰胺凝膠上分離，膠片大小為195 mm×120 mm×1 mm（長(zhǎng)×寬×高），將8μLPCR產(chǎn)物與2μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液在PCR管中混合均勻，取3μL上樣，120 V電壓下電泳3 h。

電泳結(jié)束后，用自來(lái)水沖洗玻璃板雙面，預(yù)冷；剝下凝膠，固定液（0.5%冰醋酸、10%無(wú)水乙醇）中固定20 min；用ddH2O洗滌2次，銀染液（0.15%硝酸銀）中滲透15 min；再用ddH2O洗滌2次，顯影液(1.5%氫氧化鈉、1%甲醛)中顯影10～15 min，直至出現(xiàn)清晰的DNA條帶為止；顯影后立刻用ddH2O洗滌1次，將凝膠放入全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置中進(jìn)行拍照和分析。

1.5 PAGE凝膠熒光染料顯影法顯帶

PCR產(chǎn)物在8%（29∶1）聚丙烯酰胺凝膠上分離，凝膠規(guī)格同1.4；核酸熒光染料為GelRed，采用前染方法，同1.3。將8μL PCR產(chǎn)物與2μL含有g(shù)elred的溴酚藍(lán)上樣緩沖液在PCR管中混合均勻，取3μL上樣，120 V電壓下電泳3 h。

電泳結(jié)束后，用自來(lái)水沖洗玻璃板雙面，預(yù)冷；剝下凝膠，清水沖洗后，直接放入全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置中進(jìn)行拍照和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳法

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)杏屬植物品種DNA的效果見(jiàn)圖1，圖片中的1～66分別代表杏屬的66個(gè)品種。從圖1中可以看出，杏屬66個(gè)品種的瓊脂糖凝膠電泳目的條帶清晰明亮，大小在100 bp左右，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶。但由于瓊脂糖凝膠電泳分辨率低，只能區(qū)分約相差100 bp的DNA片段，故杏屬瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果為一條清晰的目的條帶，無(wú)法判定品種間差異。

2.2 改良的微衛(wèi)星PAGE銀染法

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

改良的微衛(wèi)星PAGE銀染法檢測(cè)杏屬植物品種DNA的效果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，杏屬PAGE銀染圖片的背景、分辨率、目的條帶相對(duì)清晰，從指紋圖譜可以有效進(jìn)行品種間差異鑒定。但由于銀染步驟繁瑣，固定、銀染、顯影時(shí)間難以掌握，部分物種出現(xiàn)了染色深、背景模糊的現(xiàn)象，如品種1、5、42、53、54的指紋圖譜。此外，部分品種還容易出現(xiàn)主帶跟非特異性條帶區(qū)分不明顯的現(xiàn)象，如品種29、33、46、51、56、57的指紋圖譜。

圖2 改良銀染方法顯影結(jié)果

2.3 PAGE凝膠熒光染料顯影法

PAGE凝膠熒光染料對(duì)杏屬植物品種DNA顯色，效果非常理想，見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，杏屬66個(gè)品種PAGE凝膠熒光染料顯影顯色的條帶與PAGE銀染結(jié)果完全一致，甚至那些微弱的非特異性條帶同銀染結(jié)果也完全一致。與PAGE銀染相比，PAGE熒光染料顯影的效果更好，表現(xiàn)為圖片背景更清晰、分辨率更高、目的條帶更清晰、主帶與非特異性條帶區(qū)分更加明顯等。由于PAGE凝膠熒光染料顯色法簡(jiǎn)單易行，不會(huì)出現(xiàn)因時(shí)間控制不好導(dǎo)致染色過(guò)深或染色失敗的現(xiàn)象，因此，該方法具有更多優(yōu)越性。

圖3 凝膠熒光染料法顯影結(jié)果

3 討論與結(jié)論

常用的DNA顯帶技術(shù)有Southern雜交、瓊脂糖凝膠電泳和PAGE凝膠電泳[13]。Southern雜交因使用放射性同位素而具有放射性污染，故很少被人使用。瓊脂糖凝膠電泳可快速分別、純化和判定DNA，但其分辨率低，無(wú)法區(qū)分微衛(wèi)星DNA條帶，這一點(diǎn)在杏屬實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到了證實(shí)。聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率高（理論上可以分開(kāi)長(zhǎng)度相差0.1%的DNA分子），在顯色上以銀染技術(shù)代替同位素放射技術(shù)而獨(dú)占優(yōu)勢(shì)，故在微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析方面應(yīng)用廣泛。但PAGE銀染技術(shù)有步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、顯色時(shí)間不易控制、背景模糊等缺陷，一般而言，普通的銀染技術(shù)需要2～3 h，本實(shí)驗(yàn)采用改良的銀染技術(shù)也需要30～60 min。作者提出的PAGE熒光染料顯帶法既具有瓊脂糖凝膠電泳的快速分別、純化和判定DNA等優(yōu)點(diǎn)，又具有PAGE銀染分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，而且還簡(jiǎn)單易行，快速高效，是一種值得推廣的顯帶技術(shù)。

近些年，關(guān)于銀染技術(shù)的改良，人們進(jìn)行了大量的研究，關(guān)海濤等[14]比較了Bassam和銀染法Sanguinett銀染法的顯影效果；梁宏偉等[15]對(duì)縮短銀染時(shí)間進(jìn)行了研究；杜爽等[15]對(duì)聚丙烯酰胺凝膠的種類、濃度及其銀染方法進(jìn)行了優(yōu)化；許麗等[16]對(duì)銀染溫度和顯色溫度進(jìn)行了研究。PAGE銀染的原理是利用銀離子和核苷酸結(jié)合，在堿性環(huán)境下甲醛能使陰離子還原從而使凝膠中的DNA得以顯現(xiàn)，故PAGE銀染的步驟繁瑣、背景不清晰、甲醛危害等問(wèn)題無(wú)法從根本上得到解決。在銀染操作過(guò)程中，銀染后漂洗過(guò)度可能造成DNA帶不清晰或無(wú)帶的現(xiàn)象；AgNO3濃度高、銀染時(shí)間長(zhǎng)、銀染后漂洗時(shí)間短、顯色時(shí)間長(zhǎng)都有可能造成凝膠背景發(fā)黃、顏色過(guò)深等現(xiàn)象；另外，搖晃不均勻還可能造成顯影不均勻等現(xiàn)象。這些都是銀染技術(shù)很難避免的缺陷。

瓊脂糖電泳能快速分離、純化和判定DNA，優(yōu)勢(shì)在于核酸熒光染料的利用，如EB、SYBR系列染料、UltraPower核酸染料、GelRed和GelGreen等，原理是熒光染料以非共價(jià)鍵的方式與DNA/RNA結(jié)合，在紫外線的照射下發(fā)出明亮的橙色熒光，實(shí)現(xiàn)DNA條帶顯示。利用相同的原理，在PAGE凝膠中使用核酸熒光染料，同樣可達(dá)到高分辨率、快速判定DNA的目的，而這一方法至今沒(méi)人采用。張玉魁等[17]認(rèn)為EB毒性大，PAGE會(huì)淬滅EB的熒光，使EB檢測(cè)的靈敏度降低。本實(shí)驗(yàn)使用的是無(wú)毒的熒光染料GelRed，研究發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺對(duì)GelRed熒光并沒(méi)有產(chǎn)生淬滅作用，沒(méi)有降低GelRed的靈敏性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于PAGE核酸熒光染料顯影法省去了銀染法瑣碎的步驟，因而簡(jiǎn)單易行。

PAGE銀染、顯影的膠片質(zhì)量對(duì)統(tǒng)計(jì)分析至關(guān)重要，若膠片背景色濃、分辨率低、條帶模糊，則在統(tǒng)計(jì)時(shí)很容易誤判，導(dǎo)致分析結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至完全錯(cuò)誤[18]。微衛(wèi)星PAGE熒光染料顯影法，顯影圖片的背景、分辨率、目的條帶都更加清晰可靠，可以在微衛(wèi)星PAGE凝膠電泳上的顯帶分析上應(yīng)用。

PAGE銀染容易伴隨出現(xiàn)一些顯色較淺的非特異性條帶，Murray等[19]認(rèn)為這是由于DNA復(fù)制過(guò)程中的滑動(dòng)錯(cuò)配造成的。有時(shí)非特異性帶不能完全消除，但是它不會(huì)影響等位基因的判定，因?yàn)樵谀程囟ǖ奈稽c(diǎn)上，非特異性帶的帶型通常是固定的，并且顯影后主帶比非特異性帶清晰、易讀[20]。微衛(wèi)星PAGE熒光染料顯影法下，主帶跟非特異性條帶的區(qū)分比銀染法更加明顯?？傊⑿l(wèi)星PAGE熒光染料顯影法是一種成功的微衛(wèi)星PAGE顯影方法。

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