側(cè)腦室注射 Noggin對 AD小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生和學(xué)習(xí)記憶功能的影響

高長越, 范曉棠, 方傳勤, 王延江, 張莉莉, 李敬誠, 周華東

隨著人口老齡化,老年期癡呆越來越引起人們的關(guān)注。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年期癡呆中最常見的一種類型,臨床表現(xiàn)為不可逆進(jìn)行性發(fā)展的記憶減退、認(rèn)知下降、語言與人格障礙等。其特征性病理學(xué)改變?yōu)榇竽X皮層和海馬細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neuofibrillary tangle,NFT)、細(xì)胞外大量老年斑(senile plaque,SP)形成及神經(jīng)元缺失[1]。目前在世界范圍內(nèi)已成為引起老年人死亡的主要原因,全世界現(xiàn)有患病人數(shù)在 2千萬以上[2]。隨著我國人口老齡化問題的日益突出,對 AD的防治顯得非常迫切。到目前為止,AD在臨床上還缺乏有效的治療措施。

神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell,NSCs)增殖、存活和分化的過程稱為神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)。研究證明神經(jīng)發(fā)生主要在哺乳動物腦內(nèi)兩個區(qū)域——海馬齒狀回(subergranular zone,SGZ)、室管膜下區(qū)(suberventricular zone,SVZ)終生存在[3,4]。海馬齒狀回顆粒細(xì)胞更是在學(xué)習(xí)記憶機(jī)制中發(fā)揮重要作用。多項研究已表明 AD海馬神經(jīng)發(fā)生減低與記憶功能減退有關(guān)[5]。AD重要的病理特征之一是神經(jīng)元的丟失,因此促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生來替代治療AD是重要的臨床策略之一。既往的研究發(fā)現(xiàn),Noggin在海馬錐體細(xì)胞及齒狀回顆粒細(xì)胞有高豐度表達(dá),反義核酸抑制海馬內(nèi) Noggin表達(dá)后,可損害大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,并降低海馬齒狀回神經(jīng)增殖,提示Noggin對海馬神經(jīng)元的存活和損傷修復(fù)可能具有重要意義[6]。為此我們以 12月齡 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型為基礎(chǔ),觀察了在側(cè)腦室注射 Noggin后海馬神經(jīng)發(fā)生的變化和學(xué)習(xí)記憶功能的改變,探討了 Noggin在 AD中的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 12月齡健康雄性 APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因 AD小鼠 20只,質(zhì)量 32.2～43.1g,均源于美國 Jackson實驗室。BrdU、Noggin及抗鼠BrdU單克隆抗體購自 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 小鼠按拋硬幣法隨機(jī)分為生理鹽水對照組、Noggin注射組各 10只。注射組小鼠均經(jīng) 3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后固定于江灣Ⅰ型立體定向儀上。按 Paxinos和 Watson立體定位圖譜,以前囪為零點(diǎn),在前囪后 1.0mm、右側(cè) 1.5mm和 4.0mm深度置入不誘鋼管,導(dǎo)管外徑 0.5mm,內(nèi)徑 0.3mm,用 502膠和牙托粉泥固定于顱骨表面,便于多次側(cè)腦室注射。

1.2.2 Noggin側(cè)腦室注射 Noggin注射組給予側(cè)腦室注射,微量注射的方法:右側(cè)腦室內(nèi)導(dǎo)管插入術(shù)后,將外徑為 0.3mm的內(nèi)套管插入該導(dǎo)管內(nèi),其末端比導(dǎo)管末端長 1mm,外端經(jīng)一細(xì)塑料管 2μl微量注射器相連接,Noggin共 3μl(1μg/μl),以 0.5μl/min速度注入側(cè)腦室內(nèi),注射完畢停留 2min撥出內(nèi)套管,每天注射 1次,共 7d。生理鹽水對照組僅給予 3μl生理鹽水注射。

1.2.3 Brd U腹腔注射及免疫熒光檢測 7d注射完畢后每組各取 4只小鼠給予BrdU腹腔注射,劑量 100mg/kg,注射時在動物房通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行,抓取小鼠時盡量輕柔,避免驚嚇等刺激,每天 2次,間隔 12h,連續(xù) 4d。均于最后 1次 BrdU注射后 5d殺死動物并灌注、取材,行冠狀冰凍切片,片厚 35μm,每隔 6張取 1張切片,取其中 1套(約 10張含海馬結(jié)構(gòu))進(jìn)行免疫熒光染色并計數(shù),累加后乘 6即為一側(cè)海馬齒回總的陽性細(xì)胞數(shù)。

新鮮配置 3%H2O2,室溫浸泡 5～10min以滅活內(nèi)源性酶;4%布安液(4%甲醛/1%苦味酸/5%醋酸)固定 15min;2mol/L HCl浸泡 1h;0.1mol/L硼酸緩沖液中和 2min×3次,PBS洗滌 10min×3次,加封閉用血清,室溫 30min。滴加兔抗 Brdu一抗(1∶5000),恒溫下(4℃)孵育 24h;PBS沖洗 10min×3次,加入封閉緩沖液配制的二抗為[羊抗鼠 IgG1 Cy3(1∶500)],避光室溫 2h,避光條件下,0.01mol/L PBST洗滌 10min×3。避光條件下,貼片、避光、陰干、稀釋的甘油封片、4℃避光保存,1min內(nèi)進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 AD小鼠的行為學(xué)檢測 7d注射完畢后注射組小鼠取出套管,局部碘伏消毒并縫合皮膚,各組余下 6只 Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)檢測。水池分為 4個象限,分別稱 SW、NW、SE、NE象限,在 NE象限正中放置一直徑 6cm的平臺,平臺頂?shù)陀谒?.5cm。實驗室內(nèi)光線良好,水溫維持在(25℃ ±0.5℃),攝像機(jī)安置于水池上方 2.5m處,并與安裝有示蹤軟件的計算機(jī)相連。(1)定位航行實驗(place navigation test):實驗前 1d下午將小鼠放入水中自由游泳 2min,使其熟悉實驗環(huán)境。實驗歷時4d,每天上、下午兩個時間段,每個時間段訓(xùn)練 4次。每次訓(xùn)練隨機(jī)選擇一個入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水池,記錄小鼠找到平臺的時間,即逃逸潛伏期(escape latency)。至 90s找不到平臺,即將其引上平臺,潛伏期記為 90s。每一時間段內(nèi) 4次潛伏期的算術(shù)平均值作為這一時間段的學(xué)習(xí)成績。(2)空間探索實驗(spatial probe test):訓(xùn)練 4d平臺實驗結(jié)束后,小鼠在籠中停留 2h。然后撤除平臺,進(jìn)行空間探索實驗。將小鼠放至池中,記錄實驗小鼠在 60s內(nèi)穿越平臺所在象限的次數(shù),計算小鼠在平臺所在象限的游泳時間占總時間的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 Noggin側(cè)腦室注射對 AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 將小鼠從 1d到 4d的訓(xùn)練結(jié)果記錄下來,發(fā)現(xiàn)隨著訓(xùn)練時間的延長,各組小鼠找到平臺的時間隨著訓(xùn)練天數(shù)增加均有縮短,但下降的速率不一致,Noggin側(cè)腦室注射組小鼠平均逃逸潛伏期在每個時間段短于生理鹽水對照組(P＜0.05),我們觀察到各組小鼠中,隨著訓(xùn)練時間延長,游泳速度有減慢的傾向,但同組每天以及組間彼此之間游泳速度相差均不明顯(P＞0.05),(見圖1)?？臻g探索實驗中,Noggin側(cè)腦室注射組在原平臺象限探索時間百分率明顯大于對照組小鼠(P＜0.05);對照組大鼠穿過原平臺位置次數(shù)也明顯少于 Noggin側(cè)腦室注射組(P＜0.05)(見表1)。

2.2 各組 AD小鼠海馬齒回 BrdU的檢測BrdU作為 DNA前體類似物替代摻入 S期細(xì)胞,活體注射而后利用抗 BrdU單克隆抗體,結(jié)合熒光標(biāo)記顯示增殖細(xì)胞。本實驗可見 BrdU陽性細(xì)胞大都位于顆粒細(xì)胞層與門區(qū)之間,即所謂的顆粒細(xì)胞下層,往往緊密排列、成簇出現(xiàn),細(xì)胞形狀不規(guī)則,多呈橢圓型或圓形。Noggin側(cè)腦室注射組小鼠 BrdU陽性細(xì)胞數(shù)(232.24±16.38)與對照組(125.21±16.32)比較明顯增加,差異非常顯著(P＜0.01)(見圖2)。

表1 撤除平臺后 60s內(nèi)穿過原平臺位置次數(shù)及在原平臺象限探索時間百分比±s)

表1 撤除平臺后 60s內(nèi)穿過原平臺位置次數(shù)及在原平臺象限探索時間百分比±s)

*P＜0.05

Noggin注射組對照組41.52±6.29%*32.32±4.80%4.02±0.65*3.51±0.31

圖1 Morris水迷宮檢測 Noggin側(cè)腦室注射及對照組 AD小鼠逃逸潛伏期、游泳速度

圖2 免疫熒光檢測兩組 AD小鼠海馬 BrdU陽性細(xì)胞數(shù)(箭頭所示,200×)

3 討 論

近年來神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)領(lǐng)域的迅速發(fā)展為包括 AD在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的替代治療打開了一個全新的研究方向。研究證明在哺乳動物腦內(nèi)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層(SGZ)神經(jīng)干細(xì)胞能夠增生分化成為神經(jīng)元并整合到復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路中。在成年哺乳動物及人類的海馬齒回的NSCs的增殖、分化、遷移和整合因與記憶形成密切相關(guān)[5]。通過有效干預(yù) AD腦內(nèi)內(nèi)源性的神經(jīng)發(fā)生,從而達(dá)到對 AD相關(guān)的選擇性神經(jīng)元丟失的治療有較好前景。有關(guān) AD腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的變化,多數(shù)體內(nèi)和體外研究顯示 AD腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生下降[7～9]。其中 AD腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生下降構(gòu)成了 AD病理生理機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。因而如何促進(jìn) AD腦內(nèi)海馬的神經(jīng)發(fā)生在 AD防治領(lǐng)域具有重要意義。

Noggin與骨形成蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)是胚胎期神經(jīng)發(fā)生的重要調(diào)控分子,在原腸胚期共同參與神經(jīng)板和神經(jīng)管的發(fā)生過程,其中 BMP4抑制分離的外胚層細(xì)胞向神經(jīng)元分化,促進(jìn)這些細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化;而 Noggin作為BMP4的拮抗結(jié)合蛋白,與 BMP4的親和性較高,可阻滯 BMP4與其相應(yīng)的受體結(jié)合,從而抑制 BMP受體信號通路,促進(jìn)這些細(xì)胞向神經(jīng)元分化[10]。目前已證明,Noggin不僅在胚胎期,在成年哺乳動物 CNS與外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及神經(jīng)發(fā)生起重要作用[11]。Noggin在成年大鼠 CNS內(nèi)皮質(zhì)、海馬、嗅皮質(zhì)、小腦的蒲肯野細(xì)胞等部位的神經(jīng)元均有一定水平的表達(dá),但以前皮質(zhì)與海馬表達(dá)水平最高,前皮質(zhì)和海馬與學(xué)習(xí)記憶等腦的高級認(rèn)知功能密切相關(guān)。以前研究發(fā)現(xiàn),側(cè)腦室注射 Noggin反義寡核苷酸能抑制大鼠海馬齒狀回神經(jīng)增殖,并且明顯抑制學(xué)習(xí)記憶能力[6],表明 Noggin的確與成年大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)。本實驗所選擇的 12月齡 AD小鼠相當(dāng)于疾病的進(jìn)展階段,我們通過向 AD小鼠側(cè)腦室注射 Noggin來觀察其對海馬神經(jīng)發(fā)生和學(xué)習(xí)記憶的影響。本實驗中的Morris水迷宮是目前檢測實驗動物學(xué)習(xí)記憶水平最常用和重要的工具,是英國心理學(xué)家 Morris于20世紀(jì) 80年代初設(shè)計,并成為研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型,是目前普遍使用檢測實驗動物學(xué)習(xí)記憶水平的重要工具。本實驗參照Yau、McNair等[12]的方法進(jìn)行了改進(jìn),將測試次數(shù)、潛伏期作相應(yīng)修改,來對小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。BrdU標(biāo)記技術(shù)是目前研究神經(jīng)發(fā)生應(yīng)用最為廣泛的一項技術(shù)。非放射性標(biāo)記物 5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)為胸腺嘧啶的衍生物,摻入 S期細(xì)胞,能與內(nèi)源性胸腺嘧啶競爭摻入新合成的 DNA?；铙w注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入,而后利用抗 BrdU單克隆抗體,ICC染色,顯示增殖細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn) AD小鼠在側(cè)腦室注射 Noggin較生理鹽水注射組學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。同時,用 BrdU標(biāo)記海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖中發(fā)現(xiàn),AD小鼠在側(cè)腦室注射 Noggin較生理鹽水注射海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖增加。本研究結(jié)果表明 Noggin可促進(jìn) AD小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生,并改善 AD小鼠的學(xué)習(xí)與記憶功能。Noggin對于 AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善可能是與Noggin能促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。我們既往研究證實[13],BMP4與 Noggin調(diào)控不同年齡段大鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生。Noggin基因亦是目前在體內(nèi)與體外均被證實有神經(jīng)誘導(dǎo)作用的神經(jīng)誘導(dǎo)劑,并且分泌性Noggin蛋白與 BMPs有較高的親和力,因而干擾BMPs與相關(guān)受體的結(jié)合,因此其神經(jīng)誘導(dǎo)作用也可能主要與拮抗 BMP2/BMP4的作用有關(guān)。

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