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    組織工程支架和細(xì)胞的相互作用

    2010-08-14 01:16:02向鴻照綜述王遠(yuǎn)亮楊維虎審校
    重慶醫(yī)學(xué) 2010年22期
    關(guān)鍵詞:纖維細(xì)胞模量支架

    向鴻照綜述,王遠(yuǎn)亮,楊維虎審校

    (重慶大學(xué)生物力學(xué)與組織工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400044)

    組織工程是把支架、細(xì)胞和生長因子三者相結(jié)合,用于病變、損傷部位組織和器官的修復(fù)、重建和再生。其中支架作為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的替代物,為細(xì)胞和生長因子負(fù)載提供一個(gè)3D環(huán)境。理想的支架除了應(yīng)該具有足夠的孔隙率以利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸,還要有足夠的力學(xué)性能負(fù)載和刺激細(xì)胞,傳遞細(xì)胞信號,保證細(xì)胞的正常表型[1-3]。因此,了解組織工程中細(xì)胞和支架的相互作用對組織和器官的制備具有重要的意義。

    1 支架對細(xì)胞的作用

    理解3D支架對細(xì)胞組織的作用是組織工程研究的重點(diǎn)。支架對細(xì)胞的刺激主要是通過支架的構(gòu)型、機(jī)械性能和外力作用3種途徑實(shí)現(xiàn)的,其中對3D支架的機(jī)械性能的評估是組織工程研究的關(guān)鍵。下面分別進(jìn)行論述。

    1.1 支架模量對細(xì)胞生理功能的影響 支架的機(jī)械性能對細(xì)胞的表型、生長、遷移和繁殖等生理活動(dòng)起到調(diào)節(jié)和控制的作用[4-5],其中支架剛性(主要指楊氏模量)對細(xì)胞行為的影響最為重要。很難準(zhǔn)確定義3D支架中細(xì)胞的形態(tài)和支架剛性之間的關(guān)系,因?yàn)橹Ъ苤屑?xì)胞的表型是一個(gè)物理和生化性質(zhì)共同作用的復(fù)雜過程,除了考慮支架的模量外,還要考慮蛋白水解敏感性,細(xì)胞生長因子等因素。Daniel等[6]在研究支架模量和蛋白水解敏感度對細(xì)胞表型的影響中,發(fā)現(xiàn)在柔順支架中(0~100 Pa)生長的細(xì)胞更多表現(xiàn)出星形,而剛性較大(>500 Pa)的支架中生長的細(xì)胞則主要表現(xiàn)為圓球形,見圖1。并且對于不同的細(xì)胞和支架其相關(guān)系數(shù)是變化的。支架模量除了影響細(xì)胞的形態(tài)之外,還控制細(xì)胞的分化和遷移功能[7]。Engler和Jean[8]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)被種植在聚酰胺(PA)凝膠支架上時(shí),通過控制支架基底的模量可以影響細(xì)胞的分化。此外,當(dāng)支架的彈性模量分別相似于肌肉、腦和骨組織的彈性模量時(shí),可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化成肌細(xì)胞、神經(jīng)元、成骨細(xì)胞。并且,基體模量直接誘導(dǎo)細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)。在細(xì)胞植入初期,支架基底的模量會(huì)影響相鄰內(nèi)皮細(xì)胞融合。在Engler和Jean[8]的實(shí)驗(yàn)中PLLA/PLGA混合物的機(jī)械性能影響支架肌肉細(xì)胞的構(gòu)造、分化和成活力,剛性的PLLA/PLGA支架支持細(xì)胞聚集形成線性管狀。Reinhart等[9]發(fā)現(xiàn)采用柔軟的基底有利于細(xì)胞在支架中的黏附和保持細(xì)胞之間的接觸,剛性的基底則鼓勵(lì)細(xì)胞遷移活動(dòng),基底的彈性強(qiáng)度與細(xì)胞遷移的速度和距離相關(guān)。為了研究支架的模量對細(xì)胞繁殖的影響,Hadjipanayi等[10]和 Levy-Mishali等[11]對比成纖維細(xì)胞在剛性和柔順2種膠原支架上的生長情況,剛性支架中的成纖維細(xì)胞2 d時(shí)表現(xiàn)出較高的繁殖能力(其細(xì)胞密度為柔順支架上細(xì)胞密度的2倍),2 d時(shí)柔順支架細(xì)胞繁殖數(shù)目與剛性支架相比顯示出4 d的滯后期,6 d時(shí)柔順支架細(xì)胞繁殖數(shù)目表現(xiàn)出6 d的滯后期。

    圖1 細(xì)胞在不同硬度支架中的形態(tài)

    1.2 支架模量對細(xì)胞收縮力的影響 細(xì)胞收縮力是細(xì)胞在3D支架黏附和生長過程中,受到支架模量和構(gòu)型等因素的刺激產(chǎn)生的調(diào)控細(xì)胞應(yīng)答和響應(yīng)的力。細(xì)胞的收縮力對很多生理功能如感染、傷口愈合、血管再狹窄非常重要。支架模量對細(xì)胞收縮力的影響現(xiàn)在還沒有一個(gè)統(tǒng)一的定論,研究這方面的文獻(xiàn)也較少,有的結(jié)論甚至相互矛盾。Karamichos等[12]發(fā)現(xiàn)種植成纖維細(xì)胞在硬的膠原凝膠支架中,細(xì)胞產(chǎn)生的收縮力下降。而Yi等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示支架的硬度和細(xì)胞產(chǎn)生收縮力的強(qiáng)度成正比。與此矛盾的是,有學(xué)者通過力學(xué)測量發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的收縮力大小與支架的硬度無關(guān)。作者認(rèn)為不同的結(jié)論可能源于支架不同的應(yīng)變水平或細(xì)胞不同時(shí)期的影響,以及不同的研究模型和理論。研究支架的模量和細(xì)胞力之間的關(guān)系是一個(gè)復(fù)雜的問題。首先需要提高實(shí)驗(yàn)儀器精度以及規(guī)范操作,使用來源一致的支架并且統(tǒng)一的細(xì)胞處理技術(shù)。

    1.3 支架構(gòu)型對細(xì)胞的影響 支架作為細(xì)胞生長的外部環(huán)境,支架的構(gòu)型為細(xì)胞提供了黏附的基底和生長的空間,同時(shí)還影響細(xì)胞在支架中的密度分布,以及制備的組織器官的形狀和功能[14]。實(shí)驗(yàn)顯示,內(nèi)皮細(xì)胞種植在不同尺寸的球形支架中,當(dāng)球的直徑減小時(shí)細(xì)胞病死率增加。在微島結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞,顯示繁殖細(xì)胞的增加主要出現(xiàn)在微島的邊緣,其中細(xì)胞密度最大的部位分布在微島的角上。此外,MSCs種植在膠原3D支架微島結(jié)構(gòu)中,結(jié)果顯示分化的脂肪細(xì)胞主要聚集在微島結(jié)構(gòu)的中心部位,成骨細(xì)胞則主要分布在微島結(jié)構(gòu)的邊緣部位。說明支架構(gòu)造對細(xì)胞分化可產(chǎn)生特殊影響。Victor等[15]研究了支架材料、長度、結(jié)構(gòu)對制備工程肌腱組織的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)支架為海綿結(jié)構(gòu)時(shí)得到肌腱力學(xué)性能優(yōu)于凝膠結(jié)構(gòu)的支架;延長軸方向,長度較大的支架其制得的肌腱徑向力學(xué)性能優(yōu)于短支架;支架對細(xì)胞作用力傳遞有梯度緩沖作用。

    通過認(rèn)識(shí)支架幾何形狀對細(xì)胞行為的作用,促進(jìn)三維支架制造技術(shù)的發(fā)展,這些技術(shù)能有效地控制支架的幾何形狀,滿足組織和器官制備的需要。例如光成型技術(shù)、靜電紡絲編制技術(shù)、3D打印制備支架等。

    1.4 外力作用對細(xì)胞的影響 支架在外力作用下影響細(xì)胞的表型、分化和繁殖。不同的細(xì)胞和組織采用不同的支架、反應(yīng)器、刺激方式。機(jī)械刺激在組織生長過程提供剪切力,通過拉伸(單軸和雙軸)、靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的負(fù)載影響細(xì)胞的行為。例如collagen-glycosaminoglycan支架種植成纖維細(xì)胞,在模擬環(huán)境下拉伸方向、拉伸幅度、彈性形變次數(shù)和頻率對組織工程細(xì)胞的彈性模量都會(huì)產(chǎn)生影響[16]。在體外對種植在膠原表面的MSCs細(xì)胞應(yīng)用機(jī)械刺激,制備得到機(jī)械性能增加的肌腱組織,隨后植入體內(nèi)。此外,對人骨髓干細(xì)胞進(jìn)行的機(jī)械刺激,結(jié)果顯示這種刺激有利于骨細(xì)胞和骨組織的產(chǎn)生。最近發(fā)現(xiàn),在聚乙二醇(PEG)支架上種植關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,經(jīng)過動(dòng)態(tài)的壓力和拉伸刺激28 d,與靜止?fàn)顟B(tài)培養(yǎng)相比,細(xì)胞表現(xiàn)出很高的彈性模量。這些發(fā)現(xiàn)都表明外部的刺激能誘發(fā)細(xì)胞的生理變化,細(xì)胞的生理變化反過來又影響支架的性質(zhì)[17]。角膜成纖維細(xì)胞分別種植在單軸拉伸和無拉伸的膠原支架中,證明細(xì)胞排列和形態(tài)與支架的重排一致,細(xì)胞種植在未拉伸的支架中,自由取向,成星形狀態(tài),而細(xì)胞在拉伸環(huán)境中平行于長軸方向排列。增加支架對細(xì)胞影響的理解能更好地指導(dǎo)組織工程支架的制備。

    2 細(xì)胞對支架的作用

    支架在調(diào)控細(xì)胞行為的同時(shí)其性質(zhì)也受到細(xì)胞活動(dòng)的影響,主要表現(xiàn)為支架變形、支架降解和模量下降。支架性質(zhì)的改變是細(xì)胞物理和生化兩方面作用的結(jié)果[18]。

    一方面由于細(xì)胞活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的收縮力引起支架重新塑形。支架中細(xì)胞活動(dòng)包括伸展、收縮、遷移3個(gè)階段。首先細(xì)胞在工程支架中鋪展和黏附,在蛋白水解的幫助下伸展層形足板進(jìn)入支架內(nèi)部,細(xì)胞和細(xì)胞之間是隔開的,周圍支架不發(fā)生形變;12 h后細(xì)胞產(chǎn)生收縮力引發(fā)支架向細(xì)胞靠攏,然后誘使支架局部微小變形;3 d后支架中的細(xì)胞相向遷移,開始發(fā)生相互聯(lián)系;7 d時(shí)支架中的細(xì)胞相互連接并且產(chǎn)生聚集,引起整個(gè)支架的收縮(即支架被壓縮變形)。細(xì)胞之間的連接作用破壞了支架的彈性恢復(fù)。細(xì)胞的星形形狀有利于它們與支架基底黏附以及通過支架孔相互連接。

    另一方面是由于蛋白酶的作用。蛋白酶的作用分為3類:(1)蛋白水解酶作用[19],它們破壞支架纖維蛋白骨架,為細(xì)胞層形足板進(jìn)入3D支架內(nèi)部提供渠道。這種水解作用降低支架的模量,加速支架的降解。(2)產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)蛋白如膠原,引起支架的局部結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能發(fā)生變化。(3)調(diào)控肌動(dòng)蛋白,肌動(dòng)蛋白是控制細(xì)胞收縮作用的關(guān)鍵。其中α-SMA(alpha smooth muscle actin)對細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲合成有調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者研究了單個(gè)肌纖維細(xì)胞中α-SM A蛋白的表達(dá)與細(xì)胞收縮力的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)α-SMA對收縮力的產(chǎn)生沒有影響,但是它的存在能提高細(xì)胞的收縮力大小,兩者表現(xiàn)為一種近似的線性關(guān)系,至于原理現(xiàn)在還不清楚。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)α-SMA含量高不僅能提高肌動(dòng)蛋白絲表達(dá)和細(xì)胞的黏附性能,還可以有效地通過調(diào)節(jié)優(yōu)化細(xì)胞亞單元的空間分布實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的變形,影響細(xì)胞功能。轉(zhuǎn)換生長因子TGF-β蛋白調(diào)節(jié)能增加α-SMA的表達(dá),促進(jìn)肌纖維細(xì)胞分化。有研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1與 TGF-β3相比更能誘導(dǎo)α-SMA 表達(dá)。b FGF、PGE2能抑制 TGF-β1的表達(dá),阻礙細(xì)胞收縮力的產(chǎn)生。這些作用都是通過整合素傳遞給細(xì)胞外支架。

    除此之外,組織工程中細(xì)胞的培養(yǎng)條件[20]也會(huì)影響支架的模量。培養(yǎng)液除了提供足夠的養(yǎng)分和緩沖作用外,還含有激素和生長因子以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。考慮這些因素有利于更好地理解細(xì)胞與支架或ECM相互作用的機(jī)制。

    3 測量細(xì)胞收縮力儀器

    測量細(xì)胞收縮力和研究收縮力的調(diào)節(jié)功能是理解組織和器官的生理和病理功能的關(guān)鍵。定量細(xì)胞收縮力的大小為組織工程選擇理想的細(xì)胞和支架提供幫助。以下介紹檢測細(xì)胞收縮力的最新儀器和原理。

    CFM力學(xué)檢測儀通過傳感器記錄支架的微小形變(靈敏度為10-6m)換算成力的大小。獲得細(xì)胞對支架作用力隨時(shí)間變化的曲線圖。缺點(diǎn)是存在背景噪聲(它反映所有細(xì)胞對支架的作用,沒有生長在支架上的細(xì)胞產(chǎn)生的力也被記錄下來)。一個(gè)典型的CFM曲線能顯示106個(gè)生長在膠原支架中的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的力,推斷出某個(gè)時(shí)間細(xì)胞產(chǎn)生的力。如培養(yǎng)8 h,一個(gè)成纖維細(xì)胞可以產(chǎn)生大約0.1 n N的力。有學(xué)者對此系統(tǒng)加以改進(jìn),從測量結(jié)果中扣去背景噪音,得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。有學(xué)者測量細(xì)胞收縮力對collagen-glycosaminoglycan支架的影響,結(jié)果顯示支架中成纖維細(xì)胞密度和所產(chǎn)生的力之間呈線性關(guān)系。此外將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞種植在相同的支架上,力/時(shí)間曲線顯示單個(gè)細(xì)胞力峰值為0.3 nN(3 h)。

    Eastwood設(shè)計(jì)了更加精密的CFM(t-CFM)系統(tǒng)。t-CFM系統(tǒng)可以檢測細(xì)胞對支架的機(jī)械力反應(yīng),當(dāng)成纖維細(xì)胞種植在3D collagen-glycosaminoglycan支架中時(shí),t-CFM裝置檢測發(fā)現(xiàn)種植8 h以后細(xì)胞收縮力減少,達(dá)到一個(gè)新的平衡。顯示出細(xì)胞具有一種自我調(diào)節(jié)功能,能減少由于外界刺激對細(xì)胞的破壞和干擾。人們使用t-CFM檢查了骨髓干細(xì)胞在膠原支架中的收縮情況,結(jié)果顯示力學(xué)峰值隨供體的不同而不同。

    在t-CFM基礎(chǔ)上研制出(SIM-CFM)[21]。這種裝置可以同時(shí)獲得細(xì)胞作用力、外部載荷和支架微觀的圖像。SIMCFM能提供4個(gè)關(guān)鍵數(shù)據(jù),通過這4種數(shù)據(jù)可以確定支架形變過程。這4種數(shù)據(jù)是細(xì)胞的尺寸、細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力、動(dòng)態(tài)的細(xì)胞擾動(dòng)和支架在濕態(tài)時(shí)位移。這些數(shù)據(jù)的測定有助于衡量支架的變形和細(xì)胞力之間的關(guān)系。

    對細(xì)胞圖像的觀測可以借助原子力顯微鏡觀測細(xì)胞和支架的微觀作用。標(biāo)定細(xì)胞的空間構(gòu)型采用類似細(xì)胞間骨架聚合物F-actin的細(xì)胞角蛋白中間絲的免疫熒光染色,或者通過分子探針(Eugene OR)對細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行熒光探針標(biāo)計(jì)[22-23]。

    前面介紹這些技術(shù)對于研究工程細(xì)胞和組織的生長極為重要。合適相匹配的細(xì)胞和支架將會(huì)有助于提高組織工程技術(shù),獲得所需健康的組織器官。

    4 結(jié) 論

    本文主要是介紹組織工程中細(xì)胞和支架間的相互作用,介紹了支架的機(jī)械性能對細(xì)胞功能的影響,細(xì)胞的收縮力對支架的作用,還有最新的測量裝置和作用原理。將來的研究應(yīng)當(dāng)著重發(fā)展新的實(shí)驗(yàn)裝置,有效地定量細(xì)胞產(chǎn)生的收縮力。這些技術(shù)應(yīng)該提供一個(gè)可供操作的統(tǒng)一規(guī)范,從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性,更加精確。探討細(xì)胞與支架,細(xì)胞和細(xì)胞之間的作用將為進(jìn)一步的組織工程模型提供理論依據(jù),有助于尋找更好的組織工程支架和細(xì)胞。

    [1]Alvaro M ,Eun JK ,Cynthia A,et al.A three-dimensional scaffold with precise micro-architecture and surface micro-textures[J].Biomaterial,2009 ,30(5):4610.

    [2]Wang L,Shashi KM ,Wlilliam H,etal.Influence of microw ellbiomimetic topography on intestinalepithelial Caco-2 cellphenotype[J].Biomaterials,2009,30(8):1.

    [3]Vincenzo G ,F(xiàn)ilippo C ,Paola T ,et al.Polyactic acid fibroreinforced polycaprolactone scaffolds for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2008 ,29(5):3662.

    [4]Biman B,Subhas C.Cellpreliferationand migration in silk fibroin 3D scaffolds[J].Biomaterials,2009 ,30(2):2956.

    [5]Anthony CJ,Christoph HA ,Dietmar WH ,et al.The correlation of pore morphology,interconnectivity and physicalproperties of 3D ceramic scaffolds with bone ingrow th[J].Biomaterials,2009 ,30(29):1440.

    [6]Daniel D,Havazelet B ,Dror S.Defining the role of Matrix com pliance and proteolysis in three-Dimesionalcell spreading and remodeling[J].Biophys J,2008,94(4):2914.

    [7]Deok-Ho K ,Karam H ,Kshitiz G,et al.Mechanosensitivity offibroblast cell shape and movement to anisotropic substratum topography gradients[J].Biomaterials,2009,30(6):5433.

    [8]Engler AJ,Jean S.Biophysical Regulation of Endoderm By 3-Dimensional Fibronectin Matrix[J].Biophys J,2009,96(3):523.

    [9]Reinhart KCA,Dembo M,Hammer DA.Cell-Cell mechanical communication through compliant substrates[J].Biophys J,2008 ,95(12):6044.

    [10]Hadjipanayi E ,Mudera V ,Brow n RA.Close dependence offibroblast proliferation on collagen scaffold matrix stiffness[J].J Tissue Eng Regen Med,2008,33(5):1384.

    [11]Levy-Mishali M ,Zoldan J,Leavenberg S.Effect of scaffold stiffness on myoblast differentiation[J].Tissue Eng Part A ,2008,51(11):2607.

    [12]Karamichos D,Brown RA ,Mudera V.Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression[J].J Biomed Mater Res A,2007 ,83(4):887.

    [13]Yi F,Gong YQ ,Prabar K,et al.Spatial Coordination of Actin Polymerization and ILK-Akt2 Activity during Endothelial Cell Migration[J].Deve Cell,2009 ,16(5):661.

    [14]Cheng K,Lai YZ ,William S.Th ree-dimesnsional polymer scaffolds for high throughput cell-based assay systems[J].Biomaterials,2008 ,29(3):2801.

    [15]Victor S,Marepalli N,Jason T,et al.Effect of scaffold mmaterial,construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct[J].J Biomechan,2008,41(11):822.

    [16]Jungreuthmayer C,Jaasma S.Deformation simulation of cells seeded on a collagen-GAG scaffold in a flow perfusion bioreactor using a sequential 3D CFD-elastostatics model[J].Med Eng Phys,2009,31(4):40.

    [17]Dekel D,Shlanlamit L.Cell-scaffold mechanicalinterplay within engineered tissue[J].Semin Cell Deve Biol,2009,20(11):656.

    [18]Simon C,Geralding R,Jennifer S,et al.The relationship between the mechanical properties and cell behaviour on PLGA and PCL scaffolds for bladder tissue engineering[J].Biomaterials,2009 ,30(7):1321.

    [19]Kumiko M ,Shinichi T,Kosuke O,et al.Comparative study of silk fibroin porous scaffolds derived from salt/waterand sucrose/hexafluoroisopropanolin cartilage formation[J].J Biosci Bioeng ,2009,108(1):68.

    [20]Christophe P,Kiyoshi T ,Yasuyuki S ,et al.A method for the design of3D scaffolds forhigh-density cellattachment and determination of optimum perfusion culture conditions[J].J Biomechan,2008,41(2):1436.

    [21]Annegret H,Dahlmann N ,Belen M ,et al.Dynamic protrusive cell behaviour generates force and drives early matrix contraction by fibroblast[J].Exp Cell Res,2007,31(3):4158.

    [22]Deepak V,Ranga R.Surfactant-free Cd Te nanoparticles mixed M EH-PPV hybrid solar cell deposited by spin coating technique[J].Solar Energy Mate Solar Cells,2009,93(9):1482.

    [23]Ranjna CD,Aroop KD.Cell-interactive 3D-scaffold:advances and applications[J].Botechnol Adv,2009 ,27(2):334.

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