體外產(chǎn)氣法研究不同鉀水平日糧對(duì)綿羊瘤胃發(fā)酵的影響

郭鵬舉 高巍

近年來(lái)通過(guò)調(diào)控瘤胃發(fā)酵來(lái)提高反芻動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)性能一直是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的重點(diǎn)之一。鉀對(duì)瘤胃微生物的生長(zhǎng)以及瘤胃發(fā)酵都是必需的，不同鉀水平的日糧在很大程度上影響了瘤胃發(fā)酵模式及動(dòng)物的生產(chǎn)性能。20世紀(jì)90年代初以來(lái)，體外產(chǎn)氣法由于能夠較好地模擬瘤胃中的發(fā)酵歷程和預(yù)測(cè)體內(nèi)干物質(zhì)消化率，已被廣泛應(yīng)用。但使用此方法研究不同鉀水平日糧對(duì)綿羊瘤胃發(fā)酵影響的報(bào)道還很少。本試驗(yàn)以人工瘤胃產(chǎn)氣量、瘤胃內(nèi)pH值、NH3-N濃度、纖維酶活性、揮發(fā)性脂肪酸濃度以及干物質(zhì)、NDF、ADF的消失率作為瘤胃發(fā)酵模式的環(huán)境指標(biāo)，探討不同鉀水平日糧對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，為其在生產(chǎn)上的應(yīng)用提參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)選用4頭體重（40 kg左右）、年齡（2周歲左右）相近的健康新疆細(xì)毛羊羯羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物。常規(guī)舍飼喂養(yǎng),日糧定量分早（8：00）、晚（20：00）兩次喂給,自由飲水。

1.2 鉀源

優(yōu)級(jí)純碳酸鉀(≥99%)，江蘇化工廠生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)裝置

玻璃注射器（國(guó)產(chǎn)，100 ml）及恒溫培養(yǎng)箱。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將羊分為4組，飼喂相同鉀水平的基礎(chǔ)日糧。體外發(fā)酵底物用不同鉀水平的日糧。A組為對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧），B組（基礎(chǔ)日糧+538mg/kg），C 組（基礎(chǔ)日糧+1 084mg/kg），D 組（基礎(chǔ)日糧+1 631mg/kg），使四組的鉀水平分別達(dá)到1.4%、1.8%、2.2%和2.6%。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。在體外發(fā)酵72 h后終止培養(yǎng)，分批測(cè)定培養(yǎng)液中pH值、NH3-N、VFA、DM、NDF和ADF降解率以及附著在底物顆粒上的纖維素分解菌的羧甲基纖維素酶活（CMCase）和木聚糖酶活（XYLase）。

混合精料配方見(jiàn)表1，日糧組成見(jiàn)表2。

表1 混合精料配方及營(yíng)養(yǎng)水平

表2 體外發(fā)酵底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.5 人工瘤胃微生物培養(yǎng)液組成

參考Menke等（1979）的活體外產(chǎn)氣法進(jìn)行配制，瘤胃液與人工培養(yǎng)液的比例為1：2，加入數(shù)滴0.1%的刃天青溶液（厭氧指示劑，有游離氧存在時(shí)呈紅色，無(wú)氧時(shí)無(wú)色）。混合培養(yǎng)液，邊加熱邊用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，同時(shí)通入經(jīng)除氧銅柱除氧的CO2直至溶液褪為無(wú)色。

人工培養(yǎng)液組成如下：

①微量元素溶液 A：CaCl2·2H2O 13.2 g；MnCl2·4H2O 10.0 g；CoCl2·6H2O 1.0 g；FeCl3·6H2O 8.0 g，加蒸餾水至100 ml。

②緩沖溶液 B：NH4HCO34.0 g；NaHCO335 g，加蒸餾水至1 000 ml。

③常量元素溶液 C：NaHPO45.7 g；KH2PO46.2 g；MgSO4·7H2O 0.6 g，加蒸餾水至 1 000 ml。

④刃天青溶液0.1%（w/v）：還原劑溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），1N NaOH 4.0 ml；NaS·9H2O 625mg；加蒸餾水至 95 ml。

將以上溶液按照下列順序配制瘤胃微生物培養(yǎng)液：400 ml蒸餾水+0.1 ml溶液A+200 ml溶液B+200 ml溶液C+1 ml刃天青溶液+40 ml還原劑溶液，再加CO2飽和，并升溫至39℃。

1.6 瘤胃內(nèi)容物的采集

于早晨飼喂前2 h,由羊瘤胃內(nèi)上下左右不同位點(diǎn)采集足量瘤胃內(nèi)容物,將4只羊瘤胃內(nèi)容物混合,灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的保溫瓶中,灌滿后立即蓋嚴(yán)瓶口,迅速返回實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)4層紗布過(guò)濾后持續(xù)充入CO2氣體5 min，保溫,備用。

1.7 體外培養(yǎng)

準(zhǔn)確稱量0.2 g待測(cè)底物置于100 ml玻璃注射器（國(guó)產(chǎn)）中，加入30 ml保存于39℃水浴中含有CO2飽和的微生物培養(yǎng)液，空白管不加飼料樣品。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。排出培養(yǎng)液中氣泡，密封，記錄初始刻度后，置于39℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別記錄0、1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48、60、72 h 的氣體產(chǎn)生量，當(dāng)注射器的刻度達(dá)到80 ml時(shí)，排出氣體至35 ml。

1.8 樣品分析

1.8.1 pH值測(cè)定

在72 h將每組注射器分別取出3個(gè)，放入4℃的冰水中終止發(fā)酵,并用便攜式pH計(jì)(雷磁PHS-3C型)測(cè)定各管瘤胃液的pH值。

1.8.2 DM、NDF、ADF消失率測(cè)定

發(fā)酵殘留物用蒸餾水洗滌，4 800 r/min離心15 min，測(cè)干物質(zhì)量，用減重法計(jì)算DM、NDF、ADF的消失率。

1.8.3 NH3-N濃度測(cè)定

離心后的上清液-20℃冷凍保存。用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定NH3-N濃度（722型可見(jiàn)分光光度計(jì)）。

1.8.4 酶活

采用DNS顯色劑法進(jìn)行纖維素酶（羧甲基纖維素酶和木聚糖酶）的活性測(cè)定，用722型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。

1.8.5 VFA的測(cè)定

采用高效氣相色譜法測(cè)定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)整理，用SAS中的NLIN模型計(jì)算產(chǎn)氣速率、延滯期和最大產(chǎn)氣量，方差分析采用SAS8.1軟件中的One-way Anova進(jìn)行，均值的多重比較采用Duncan's法進(jìn)行，各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鉀水平日糧對(duì)綿羊產(chǎn)氣量的影響（見(jiàn)表3、圖1）

表3 不同鉀水平日糧對(duì)72 h產(chǎn)氣量的影響

由表3和圖1可以看出，對(duì)照組A組、D組與B組、C組之間最大產(chǎn)氣量差異極顯著（P＜0.01）；A組和D組之間差異不顯著（P＞0.05）；B組和C組之間差異也不顯著（P＞0.05）。各組之間的產(chǎn)氣速率的變化同最大產(chǎn)氣量變化，且差異極顯著（P＜0.01）。各組之間的延滯期沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。隨著日糧中鉀水平的增加，最大產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率有提高的趨勢(shì)，且在鉀水平達(dá)到1.8%時(shí)產(chǎn)氣量達(dá)到最高，在鉀水平達(dá)到2.6%時(shí)最大產(chǎn)氣量又接近于對(duì)照組。

2.2 不同鉀水平日糧對(duì)綿羊瘤胃pH值、NH3－N濃度和酶活的影響（見(jiàn)表4）

由表4可看出，隨著日糧中鉀水平的增加，綿羊瘤胃pH值有先降后升的趨勢(shì)，但各組之間差異并不顯著（P＞0.05）；隨著日糧中鉀水平的增加，NH3－N 濃度與羧甲基纖維素酶活、木聚糖酶活各組之間差異也不顯著（P＞0.05）。值得注意的是，羧甲基纖維素酶活與木聚糖酶活都在鉀水平含量1.8%時(shí)活性達(dá)到最高（P＞0.05）。瘤胃pH值和NH3－N濃度卻在鉀水平含量1.8%時(shí)最低（P＞0.05）。

表4 不同鉀水平日糧培養(yǎng)72 h后對(duì)瘤胃pH值、NH3－N濃度和酶活的影響

2.3 不同鉀水平日糧對(duì)DM、NDF和ADF降解率的影響（見(jiàn)表5）

表5 不同鉀水平日糧培養(yǎng)72 h后對(duì)DM、NDF和ADF降解率的影響（%）

由表5可以看出，隨著日糧中鉀水平的升高，DM降解率表現(xiàn)出先升后降，在鉀水平達(dá)到2.2%時(shí)達(dá)到最高，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）；隨著日糧中鉀水平的升高，NDF也表現(xiàn)出先升后降，也在鉀水平達(dá)到2.2%時(shí)達(dá)到最高，但各組之間差異也不顯著（P＞0.05）；ADF的降解率在鉀水平2.2%時(shí)達(dá)到最高，且與A組差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同鉀水平日糧對(duì)瘤胃VFA的影響（見(jiàn)表6）

由表6可以看出，隨著日糧中鉀水平的升高，乙酸濃度在B組即鉀含量為1.8%時(shí)達(dá)到最高，且與A組、D組差異顯著（P＜0.05），其他各組之間差異沒(méi)有達(dá)到顯著水平；丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度在鉀水平1.8%時(shí)達(dá)到最高，但與其他各組間的差異并不顯著（P＞0.05）；對(duì)于乙酸/丙酸值，鉀水平 1.8%時(shí)最接近 3：1，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表6 不同鉀水平日糧培養(yǎng)72 h后對(duì)瘤胃VFA的影響

3 討論

3.1 不同鉀水平日糧對(duì)綿羊產(chǎn)氣量的影響

Menke等提出的體外產(chǎn)氣法能夠較好地模擬瘤胃中的發(fā)酵歷程，用產(chǎn)氣法模擬瘤胃發(fā)酵，測(cè)定快速準(zhǔn)確、重復(fù)性較好，設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，可以用來(lái)評(píng)定反芻動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、瘤胃內(nèi)能量載體物質(zhì)和含氮物質(zhì)釋放的同步性、飼草料和不同來(lái)源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組合效應(yīng)及瘤胃內(nèi)發(fā)酵動(dòng)態(tài)過(guò)程等。體外產(chǎn)氣量主要與飼料碳水化合物的消化率高度相關(guān)，而與蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)并不密切。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著日糧中鉀水平的增加，最大產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率有提高的趨勢(shì)，且在鉀水平達(dá)到1.8%時(shí)產(chǎn)氣量達(dá)到最高，在鉀水平達(dá)到2.6%時(shí)最大產(chǎn)氣量又接近于對(duì)照組。原因可能是鉀水平過(guò)高可能影響瘤胃液滲透壓，從而影響了瘤胃微生物的生長(zhǎng)和繁殖，使飼料的發(fā)酵效率下降。Warner和Stacy(1977)研究了用高鉀離子導(dǎo)致瘤胃滲透壓升高的試驗(yàn)，礦物質(zhì)添加劑可造成瘤胃中離子和分子濃度升高，從而使瘤胃液滲透壓升高。

3.2 不同鉀水平日糧對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響

瘤胃pH值是一項(xiàng)反映瘤胃內(nèi)環(huán)境和發(fā)酵水平的綜合指標(biāo)，是食糜中揮發(fā)性脂肪酸與唾液中緩沖鹽相互作用的結(jié)果，在活體內(nèi)還要考慮瘤胃上皮對(duì)揮發(fā)性脂肪酸吸收以及隨食糜流出等因素綜合作用。當(dāng)瘤胃pH值低于5.5時(shí)，瘤胃微生物蛋白的合成效率就會(huì)受到一定的影響（Calsamiglia等，2002）。本試驗(yàn)研究中四個(gè)試驗(yàn)組pH值在6.74～6.77范圍內(nèi)變動(dòng)，變化幅度很小，均處于正常生理范圍內(nèi)（pH值5.5～7.5），不會(huì)影響人工瘤胃的發(fā)酵功能。pH值穩(wěn)定的原因可能與瘤胃液的緩沖能力有關(guān)；pH值變化的原因可能是瘤胃微生物的活力受到鉀水平的影響，產(chǎn)出的有機(jī)酸濃度不同造成的。

NH3－N是飼料蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其他非蛋白氮化合物分解的終產(chǎn)物，同時(shí)又是微生物合成菌體蛋白的原料，其濃度是反映瘤胃內(nèi)氮源降解與微生物利用氨的動(dòng)態(tài)指標(biāo)。NH3－N濃度不僅受到飼料蛋白的影響,而且受飼料能量水平、氮在瘤胃內(nèi)的吸收、微生物的利用以及瘤胃食糜進(jìn)入后段消化道速度的影響。瘤胃微生物需要一定濃度的氨態(tài)氮,最佳濃度范圍 6～30mg/100 ml（Preston 和 Leng，1987）。Satter和Roffler(1974)試驗(yàn)表明，氨態(tài)氮濃度小于2.5mg/100 ml時(shí)，發(fā)酵的“解偶聯(lián)”作用引起微生物產(chǎn)量降低，生產(chǎn)效率下降，該值被廣泛用作最低氨態(tài)氮濃度標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)中氨態(tài)氮濃度均在正常范圍內(nèi)。

VFA是反芻動(dòng)物賴以生存、保持正常生長(zhǎng)、泌乳、繁殖的主要能源，可給反芻動(dòng)物70%～80%的能量（Martin和 Van，1996），因此，VFA 濃度也是瘤胃發(fā)酵的主要指標(biāo)之一。大量研究表明，對(duì)瘤胃pH值進(jìn)行調(diào)控，可直接影響VFA的產(chǎn)生與利用，本試驗(yàn)中pH值變化不大，導(dǎo)致VFA變化也不大。在鉀水平達(dá)到1.8%時(shí)，乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度達(dá)到最大。而乙酸/丙酸值，均接近3：1，乙酸和丙酸處于相對(duì)平衡的狀態(tài)。

3.3 不同鉀水平日糧對(duì)飼料降解率及酶活的影響

鉀在體內(nèi)的功能主要是參與維持酸堿平衡和滲透壓，還參與細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的代謝過(guò)程，特別是通過(guò)激活A(yù)TP酶參與碳水化合物代謝。鉀在反芻動(dòng)物瘤胃中的功能是在前胃內(nèi)容物中保持一定的緩沖作用和水分水平，即造成供微生物發(fā)酵的適宜環(huán)境。Burrough(1951)發(fā)現(xiàn)鉀是瘤胃微生物所必需的礦物元素之一，參與瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成和酶的激活過(guò)程。鉀對(duì)正常瘤胃微生物活動(dòng)是必不可少的,尤其對(duì)分解纖維素的微生物更是不可缺少。Hubbert等（1958）研究表明,體外人工瘤胃培養(yǎng)時(shí),隨著鉀添加量的增加,纖維的消化率明顯提高。Phllipson（1953）研究結(jié)果顯示，瘤胃液中鉀含量為99～175mg/100 ml。本試驗(yàn)中，羧甲基纖維素酶活與木聚糖酶活都在鉀水平含量1.8%時(shí)活性達(dá)到最高，但DM、NDF和ADF的降解率卻在鉀水平含量2.2%時(shí)最高，只是差異沒(méi)有達(dá)到顯著水平。影響酶活的因素主要有兩方面，一是分泌酶的細(xì)菌受到破壞和抑制，二是酶活本身受到抑制。由于瘤胃微生物系統(tǒng)的高度復(fù)雜性，產(chǎn)生差異的因素很多。在本試驗(yàn)結(jié)果中與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的DM、NDF和ADF的降解率都比對(duì)照組高，這也說(shuō)明高鉀日糧能提高飼料的降解率，同一些學(xué)者的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

家畜對(duì)鉀的最大耐受量為占日糧干物質(zhì)的3%。通過(guò)本試驗(yàn)可以知道，并不是飼料鉀水平越高對(duì)瘤胃發(fā)酵越有利。本試驗(yàn)中在鉀水平達(dá)到1.8%和2.2%時(shí)，最有利于綿羊瘤胃內(nèi)發(fā)酵。

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