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    單雙波長(zhǎng)在生物活性測(cè)定中的比較研究

    2010-07-30 09:14:00
    關(guān)鍵詞:酶標(biāo)儀原液成品

    趙 鴻

    (北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司,北京 100041)

    生物制品活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)大多用MTT法,使用酶標(biāo)儀掃描比色,通過(guò)數(shù)據(jù)分析得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)兩種測(cè)定模式[1-2],而且采用的都是垂直光路。選擇單波長(zhǎng)測(cè)定就是選擇測(cè)定波長(zhǎng)[3],直接測(cè)定樣本的吸光度。而雙波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)采用不同的波長(zhǎng),即測(cè)定波長(zhǎng)(主波長(zhǎng))和參比波長(zhǎng)(次波長(zhǎng))同時(shí)測(cè)定樣品的吸光度,以清除一些外在影響因素,提高測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。但鑒于日常工作關(guān)于單雙波長(zhǎng)對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度不是很了解,因此想通過(guò)此次比較實(shí)驗(yàn)了解單雙波長(zhǎng)對(duì)生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小以及單雙波長(zhǎng)哪個(gè)更適合于生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Emax酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司);單道移液器[1ml(Gilson)、200 μl(Gilson)、20 μl(Gilson)];8 道移液器(Finnpipette)。

    1.2 試藥

    本公司生產(chǎn)的 IL-11 成品(批號(hào):20080801,600 U IU/支);IL-11 原液(批號(hào):20080804,4.563 mg/ml)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 MTT比色法

    B9-11細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)時(shí)離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,以10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/ml,每孔加入 50 μl細(xì)胞懸液,再加入 50 μl待測(cè)的樣品(空白對(duì)照孔加 50 μl培養(yǎng)基),在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 72 h后,每孔加入 5 mg/ml的 MTT溶液 10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,而后加入MDF裂解液100 μl,37℃孵育過(guò)夜,酶標(biāo)儀掃描570 nm或570 nm+630 nm測(cè)定OD值,使用軟件SOFTmaxPRO 3.1分析得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    2.2 單雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果比較

    本公司生產(chǎn)的 IL-11成品(批號(hào):20080801,600 U IU/支)和 IL-11 原液(批號(hào):20080804,4.563 mg/ml)的單波長(zhǎng) 570 nm和雙波長(zhǎng)570 nm+630 nm測(cè)定結(jié)果的比較[1],見(jiàn)表1、2。

    由表1、2可知,成品和原液相應(yīng)的單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果相接近,單波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)方差和CV(%)明顯高于雙波長(zhǎng)。

    表1 IL-11成品兩種測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Resluts of two detecting methods of finished product IL-11

    表2 IL-11原液兩種測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Resluts of two detecting methods of original liquid IL-11

    2.3 IL-11成品單雙波長(zhǎng)各掃描兩次測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性比較[4] 見(jiàn)表3。

    表3 IL-11成品單雙波長(zhǎng)兩次測(cè)定結(jié)果Tab.3 Resluts of Dual-wavelength method of finished product IL-11

    由表3可知,單波長(zhǎng)兩次測(cè)定結(jié)果比雙波長(zhǎng)兩次測(cè)定結(jié)果差異大,雙波長(zhǎng)測(cè)定兩次的結(jié)果重復(fù)性好于單波長(zhǎng)。

    2.4 IL-11成品單雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差的比較 見(jiàn)表4。

    表4 IL-11成品兩種測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差Tab.4 RSD of two kinds of detecting methods of finished product IL-11

    由表4可知,單波長(zhǎng)測(cè)定方法的相對(duì)偏差明顯高于雙波長(zhǎng)測(cè)定。

    2.5 IL-11樣品生物活性測(cè)定細(xì)胞空白吸光度的比較 見(jiàn)表5。

    表5 IL-11樣品生物活性測(cè)定細(xì)胞空白對(duì)照孔吸光度OD值Tab.5 Blank absorbance on bioactivity detection of sample IL-11

    由表5可知,雙波長(zhǎng)可以排除一部分劃痕和洗滌劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的可能干擾,其吸光度OD值明顯小于單波長(zhǎng)。

    為了降低檢驗(yàn)成本,生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)所使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均非一次性使用,不可避免的存在劃痕和洗滌劑等殘留物。

    3 討論

    單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)通過(guò)對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如570 nm進(jìn)行吸光度測(cè)定[1],而雙波長(zhǎng)測(cè)定則是酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如570 nm和非敏感波長(zhǎng)630 nm下各測(cè)定1次,敏感波長(zhǎng)下的吸光度為特異性顯色的吸光度與板底被贓物(包括劃痕)污染后的吸光度之和,非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定的是改變波長(zhǎng)到一定值,使特異顯色的吸光值為零,此時(shí)測(cè)得的吸光度即為贓物的吸光度,最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)吸光度值與非敏感波長(zhǎng)的吸光度值的差。

    酶標(biāo)儀采用垂直光路,特點(diǎn)是樣品吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小,但受被測(cè)樣品液面是否水平、細(xì)胞板的透光性、孔底是否平整等因素的影響較大。 因此孔與孔之間存在一定的差異。

    酶標(biāo)儀在用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí),除受到測(cè)定的干擾和電路干擾等因素外,受液體表面張力的影響也很大。由于表面張力的作用,液體的表面不是一個(gè)平面,而是形成一個(gè)凹液面,光線(xiàn)通過(guò)液體時(shí),除被液體吸收一部分,還有一部分被折射和反射,影響吸光度的檢測(cè),且使用的洗滌劑均含有表面活性劑,這樣液面會(huì)更凹,對(duì)單波長(zhǎng)的影響更大。雙波長(zhǎng)的測(cè)定時(shí)采用兩個(gè)不同波長(zhǎng)(測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng))同時(shí)測(cè)定一個(gè)樣品的吸光度,它們的差值是樣品相對(duì)準(zhǔn)確的吸光度,這樣就會(huì)減少了測(cè)定干擾和電路干擾。

    雙波長(zhǎng)差吸光度法具有可以克服一些外界環(huán)境的影響[5-6],共存組分吸收譜疊加的干擾,以及減少比色的光學(xué)不均一性等特點(diǎn),吸光度在一定的范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

    因此,雙波長(zhǎng)測(cè)定明顯比單波長(zhǎng)更適合于生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn),其可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的準(zhǔn)確度,減少實(shí)驗(yàn)誤差。

    [1]邱娜.酶標(biāo)儀單、雙波長(zhǎng)檢測(cè)的比較[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2007,9(1):61.

    [2]李正勇.酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)技術(shù)分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2005,21(1):24.

    [3]梁雙吟,李小云,莊祥龍.酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)的比較[J].海南醫(yī)學(xué),2006,17(3):113.

    [4]阮艷秋,陳志遠(yuǎn).酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)和單波長(zhǎng)檢測(cè)技術(shù)分析[J].西部醫(yī)學(xué),2008,20(1):180-183.

    [5]林開(kāi)生,鄧勉君.酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)和單波長(zhǎng)選擇的測(cè)試對(duì)比[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2004,10(12):150.

    [6]李雪志.雙波長(zhǎng)差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展前景[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1996,3(1):58.

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