免標(biāo)記法快速檢測(cè)啶蟲(chóng)脒的研究

王承克+陳丹+張俊俊+陸峰

摘要：發(fā)展了一種利用納米金探針，免標(biāo)記法檢測(cè)啶蟲(chóng)脒的方法。本方法基于適配體能夠使納米金在NaCl溶液中保持一定的穩(wěn)定性，當(dāng)啶蟲(chóng)脒存在時(shí)，由于啶蟲(chóng)脒與適配體特異性的相互作用，使納米金穩(wěn)定性降低，在NaCl存在時(shí)發(fā)生聚集的原理，根據(jù)溶液吸收光譜630 nm波長(zhǎng)處吸光度值的改變，利用酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)了啶蟲(chóng)脒的快速定量檢測(cè)。檢測(cè)線性范圍為2～20 nmol/L，檢測(cè)限為2 nmol/L，檢測(cè)過(guò)程在5 min內(nèi)即可完成。本方法還成功用于實(shí)際水樣（校園湖水）中啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)。結(jié)果表明此方法具有較好的選擇性和較高的靈敏度，對(duì)解決農(nóng)產(chǎn)品和食品中農(nóng)藥殘留等食品安全問(wèn)題具有重要意義。

關(guān)鍵詞：啶蟲(chóng)脒；納米金；適配體；酶標(biāo)儀；檢測(cè)

中圖分類號(hào)： O657.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0324-04

啶蟲(chóng)脒（acetamiprid）是一種被廣泛使用的煙堿類高效殺蟲(chóng)劑，具有很強(qiáng)的觸殺、胃毒和內(nèi)吸殺蟲(chóng)作用，主要作用于昆蟲(chóng)神經(jīng)突觸后膜的乙酰膽堿受體，起到殺蟲(chóng)作用[1-2]。由于其對(duì)于哺乳動(dòng)物具有較低的毒性，同時(shí)與目前常見(jiàn)的有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥不存在交叉抗性，啶蟲(chóng)脒在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中被廣泛使用。然而，由于過(guò)量使用或不當(dāng)操作，在農(nóng)產(chǎn)品或食品中有時(shí)會(huì)存在一定程度的農(nóng)藥殘留，特別是在谷物、蔬菜和水中累積的啶蟲(chóng)脒會(huì)對(duì)人體健康帶來(lái)隱患，對(duì)人體外周血淋巴細(xì)胞具有一定的毒性，還會(huì)誘發(fā)DNA損傷；啶蟲(chóng)脒在水體中的殘留對(duì)于水生生物，如魚(yú)、蝦、藻類等具有高致毒性，對(duì)于家蠶、鳥(niǎo)類、蜜蜂等也有較高的毒性，給環(huán)境安全帶來(lái)隱患，也給農(nóng)業(yè)帶來(lái)較大的損失[3-6]。因此，農(nóng)產(chǎn)品、食品和水體中啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)對(duì)于保障食品安全具有重要意義。

目前，常見(jiàn)的檢測(cè)啶蟲(chóng)脒的方法包括高效液相色譜、氣相色譜和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等[7-11]，盡管這些方法可以用于靈敏檢測(cè)實(shí)際樣品中的啶蟲(chóng)脒，但是由于所用儀器昂貴，耗時(shí)較長(zhǎng)，且操作繁瑣，限制了其在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用。建立一種快速、靈敏、便捷地檢測(cè)食品中啶蟲(chóng)脒的方法對(duì)于保障食品安全很有必要。

適配體是一種經(jīng)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出的能與待測(cè)分子發(fā)生特異性相互作用的DNA/RNA片段，由于其合成便利、成本低、易于設(shè)計(jì)、親和力強(qiáng)、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于小分子的檢測(cè)[12-15]。另一方面，功能化的納米金探針作為一種新型的傳感器，具有易于制備、易于功能化，且具有很好的光學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，在金屬離子、蛋白質(zhì)、小分子的檢測(cè)中受到人們的日益關(guān)注[16-19]。近年來(lái)，也有一些報(bào)道以適配體功能化納米金為探針對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)，例如，Luo等利用半胱胺功能化納米金在適配體存在時(shí)，加入四環(huán)素前后溶液吸收光譜的改變，對(duì)四環(huán)素進(jìn)行靈敏檢測(cè)[20]；Chen等利用納米金和熒光分子修飾的適配體的相互作用，通過(guò)測(cè)定溶液熒光光譜的改變實(shí)現(xiàn)了對(duì)卡那霉素的靈敏檢測(cè)[21]；Peinetti等通過(guò)測(cè)定納米金和適配體相互作用后加入磷酸腺苷時(shí)阻抗的變化，實(shí)現(xiàn)了磷酸腺苷的靈敏檢測(cè)[22]。以上研究都顯示出較好的選擇性和較高的靈敏度，然而，由于實(shí)驗(yàn)中需要用到熒光光譜儀、電化學(xué)工作站等儀器，在快速簡(jiǎn)便檢測(cè)小分子方面存在一定不足，利用實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的固定波長(zhǎng)酶標(biāo)儀對(duì)實(shí)際樣品中的啶蟲(chóng)脒進(jìn)行快速靈敏檢測(cè)具有一定的創(chuàng)新性。

基于啶蟲(chóng)脒與適配體特異性的相互作用和納米金在分散和聚集狀態(tài)時(shí)吸收光譜的改變，本研究擬發(fā)展一種免標(biāo)記的新方法，以實(shí)現(xiàn)緩沖溶液和實(shí)際水樣中啶蟲(chóng)脒的高選擇性和快速靈敏檢測(cè)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

啶蟲(chóng)脒、異稻瘟凈、硫酸卡那霉素購(gòu)于Aladdin化學(xué)試劑有限公司，赭曲霉毒素A購(gòu)于新加坡Pribolab公司，二水合氯金酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，根據(jù)文獻(xiàn)[23]選取能與啶蟲(chóng)脒發(fā)生相互作用的適配體（5′-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTAT GAAGA-3′），并由上海生工生物工程股份有限公司合成純化，使用前溶于去離子水中，試驗(yàn)用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

溶液紫外-可見(jiàn)光譜掃描使用Varian Cary 100紫外可見(jiàn)光譜儀（美國(guó)），溶液630 nm處波長(zhǎng)記錄使用Multiscan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)）。

1.2緩沖溶液中啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)

粒徑為13 nm的納米金，利用文獻(xiàn)[24-25]方法，使用檸檬酸鈉還原氯金酸溶液法制備。向100 μL納米金溶液中加入終濃度為40 nmol/L的適配體和不同濃度的啶蟲(chóng)脒后，再加入NaCl溶液，使其終濃度為150 mmol/L，反應(yīng)10 min，利用酶標(biāo)儀記錄溶液630 nm處吸光度值。

2結(jié)果與討論

2.1傳感器的設(shè)計(jì)原理

表面包覆有檸檬酸根離子的納米金由于表面所帶的負(fù)電荷，相互排斥，在溶液中保持分散狀態(tài)，當(dāng)加入NaCl時(shí)，由于NaCl破壞了納米金表面的雙電層，使納米金的穩(wěn)定性大大降低，從分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，溶液顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色，相應(yīng)的溶液光譜會(huì)發(fā)生紅移，630 nm處吸光度值也會(huì)明顯增加[26]，如圖1所示。當(dāng)適配體單鏈DNA存在時(shí)，納米金表面的檸檬酸根被適配體取代，由于DNA側(cè)鏈磷酸基團(tuán)與納米金非特異性相互作用，使納米金帶負(fù)電，當(dāng)加入一定濃度的NaCl時(shí)，納米金可以保持一定的穩(wěn)定性而不發(fā)生聚集，溶液顏色仍為紅色。而當(dāng)待測(cè)物質(zhì)啶蟲(chóng)脒存在時(shí)，由于啶蟲(chóng)脒與適配體特異性親和作用，適配體構(gòu)型發(fā)生改變，從納米金表面脫落，再加入NaCl時(shí)，納米金會(huì)發(fā)生明顯聚集，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。隨待測(cè)溶液中啶蟲(chóng)脒濃度的改變，納米金溶液光譜也逐漸改變[27]，基于此可以方便快捷地檢測(cè)溶液中的啶蟲(chóng)脒。

2.2可行性論證

為驗(yàn)證試驗(yàn)的可行性，在納米金探針溶液中加入適配體和不同濃度的啶蟲(chóng)脒，最后加入不同濃度的NaCl溶液，如圖2所示，當(dāng)溶液中不含有啶蟲(chóng)脒時(shí)，溶液光譜最大吸收峰位于520 nm處，而當(dāng)溶液中存在50 nmol/L啶蟲(chóng)脒時(shí)，溶液光譜明顯紅移，520 nm處吸光度降低，而630 nm處吸光度值明顯增大，此現(xiàn)象說(shuō)明啶蟲(chóng)脒與適配體的結(jié)合使納米金的穩(wěn)定性降低?；谠撔再|(zhì)可用于啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)。后續(xù)試驗(yàn)為了減少光譜測(cè)定時(shí)間，簡(jiǎn)化操作步驟，選取630 nm作為溶液特征吸收波長(zhǎng)，同時(shí)使用了能快速（1～2 s）、高通量測(cè)定溶液630 nm處吸光度值的酶標(biāo)儀。

2.3試驗(yàn)條件的優(yōu)化

使用免標(biāo)記法測(cè)定啶蟲(chóng)脒，溶液光譜變化與試驗(yàn)反應(yīng)條

件密切相關(guān)，包括適配體濃度、NaCl濃度、加入NaCl后反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體系的pH值等。為使該傳感器獲得最佳的檢測(cè)性能，分別對(duì)上述試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

試驗(yàn)結(jié)果表明，適配體濃度在40 nmol/L時(shí)，如圖3A所示，隨著所加入的NaCl濃度逐漸增加，加入50 nmol/L啶蟲(chóng)脒前后，納米金溶液在630 nm處吸光度值逐漸產(chǎn)生差異，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到150 mmol/L時(shí)，加入啶蟲(chóng)脒前后溶液630 nm處吸光度值存在最大差異，繼續(xù)增加NaCl濃度，吸光度值差值逐漸減小。這是由于當(dāng)NaCl濃度較低時(shí)，納米金溶液始終保持較為穩(wěn)定狀態(tài)，納米金呈分散狀態(tài)，溶液光譜差異較小，而當(dāng)NaCl濃度較高時(shí)，即使不存在啶蟲(chóng)脒的競(jìng)爭(zhēng)性作用，吸附在納米金表面的適配體也不足以維持納米金溶液的分散狀態(tài)，即溶液中的納米金已經(jīng)完全聚集，造成溶液630 nm處吸光度值差異減??；只有在NaCl濃度適中時(shí)，由于啶蟲(chóng)脒的競(jìng)爭(zhēng)性作用，吸附在納米金表面的適配體脫落，使其穩(wěn)定性降低，而不存在啶蟲(chóng)脒的溶液，由于納米金表面的適配體的保護(hù)作用，使納米金在加入NaCl后保持分散狀態(tài)，溶液630 nm處吸光度值差異最大。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明，在加入NaCl 5 min后，吸光度值即保持穩(wěn)定。因此，本試驗(yàn)選擇40 nmol/L為適配體最佳濃度，150 mmol/L 為最適NaCl濃度，在加畢NaCl后反應(yīng)5 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液在630 nm處吸光度值。

試驗(yàn)還對(duì)體系pH值進(jìn)行優(yōu)化，如圖3B所示，當(dāng)pH值在5.5～8.5間，溶液在630 nm處吸光度值均比不含有啶蟲(chóng)脒的溶液吸光度值大，在pH值為 7.5時(shí)存在最大差異，這可能是由于不同pH值時(shí)，納米金與適配體親和力存在差異，同時(shí)不同pH值對(duì)納米金穩(wěn)定性也存在一定影響。后續(xù)試驗(yàn)中，采用pH值為 7.5作為最佳試驗(yàn)條件。

2.4啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)曲線

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，考察該傳感器對(duì)啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)能力。圖4為納米金溶液中含有不同濃度啶蟲(chóng)脒時(shí)630 nm處吸光度值的變化。從圖4可以看出，在0～50 nmol/L濃度范圍內(nèi)，溶液630 nm處吸光度值隨啶蟲(chóng)脒濃度的增加而增加，說(shuō)明隨著啶蟲(chóng)脒的增加，結(jié)合在納米金表面的適配體量逐漸減少，納米金在NaCl存在時(shí)的穩(wěn)定性也逐漸降低。圖4插圖顯示在 2～20 nmol/L范圍內(nèi)，溶液在630 nm處吸光度值與啶蟲(chóng)脒濃度線性相關(guān)。線性方程為D630 nm=0.272 7+ 0.001 3 Cacetamiprid，相關(guān)系數(shù)（R2=0.94），傳感器對(duì)啶蟲(chóng)脒檢出限為2 nmol/L。

2.5方法的選擇性

試驗(yàn)還考察了該傳感器對(duì)啶蟲(chóng)脒的選擇性，結(jié)果如圖5所示，在相同試驗(yàn)條件下，當(dāng)溶液中存在50 nmol/L赭曲霉毒素A（真菌毒素）、異稻瘟凈（農(nóng)藥）或卡那霉素（獸藥）時(shí)，溶液在630 nm處吸光度值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其對(duì)于目標(biāo)分子啶蟲(chóng)脒的響應(yīng)，表明該傳感器對(duì)啶蟲(chóng)脒有著較高的選擇性，該方法有很好的特異性。

2.6實(shí)際樣品的檢測(cè)

為了驗(yàn)證該免標(biāo)記傳感器的實(shí)用性，本研究對(duì)實(shí)際水樣（取自校園湖水）加標(biāo)，進(jìn)行啶蟲(chóng)脒的回收率試驗(yàn)。在測(cè)定前，水樣首先用0.45 μm孔徑的濾芯過(guò)濾以去除其中的固體雜質(zhì)，再利用本研究所建立的方法，在最優(yōu)化條件下對(duì)啶蟲(chóng)脒進(jìn)行定量分析，表1結(jié)果表明，當(dāng)加入的啶蟲(chóng)脒在5～20 nmol/L 時(shí)，回收率為90%～109%，RSD低于9%，說(shuō)明該傳感器能夠用于實(shí)際樣品中啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)。

3結(jié)論

本研究利用啶蟲(chóng)脒[28]與其適配體特異性的相互作用以及納米金優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建了一種快速、靈敏檢測(cè)溶液中啶蟲(chóng)脒的方法，具有較好的靈敏度和特異性，操作簡(jiǎn)便，有望用于農(nóng)產(chǎn)品或食品安全的快速分析。

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