• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    15N標記L-胱氨酸

    2010-07-18 01:25:56湯財?shù)?/span>李美華宋家龍陸平曄杜曉寧
    同位素 2010年2期
    關(guān)鍵詞:丙二酸胱氨酸硫醚

    羅 勇,湯財?shù)?李美華,宋家龍,陸平曄,杜曉寧

    (上?;ぱ芯吭荷虾7€(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心,上海 200062)

    15N是氮元素的穩(wěn)定同位素之一,可以用作示蹤元素,廣泛應用于生物化學、醫(yī)學、藥物學、農(nóng)業(yè)科學等領(lǐng)域。15N標記氨基酸和多肽是研究醫(yī)學和生命科學的重要工具,在蛋白質(zhì)的人工合成、判定生物活性物質(zhì)(多肽、蛋白質(zhì))的化學結(jié)構(gòu)及藥用機理等方面起著獨特的示蹤作用,其應用越來越廣泛,市場前景良好[1]。L-胱氨酸和L-半胱氨酸均為含硫氨基酸,屬人體非必需氨基酸,在體內(nèi)均可由蛋氨酸轉(zhuǎn)變而來。其中,從L-半胱氨酸出發(fā)可生成谷胱甘肽(G-SH),由于其活性基團巰基的存在,使之具有許多重要的生理功能,如整合解毒作用、增強肝功能、抗氧化作用和促進毛發(fā)生長等。L-胱氨酸同時也是多種硬蛋白質(zhì)如角質(zhì)蛋白的重要成分。

    L-胱氨酸廣泛存在于動物的毛、發(fā)、骨、角中,目前工業(yè)上主要采用生物化學方法,經(jīng)由蛋白質(zhì)(如毛發(fā))水解、分離、精制而成。L-胱氨酸的化學生產(chǎn)具有較大的難度,合成過程中需對巰基進行保護和解保護[1-2]。此外,經(jīng)化學方法合成的通常為消旋的D,L-氨基酸,不具有光學活性,必須經(jīng)化學或酶法拆分以得到有光學活性的L型產(chǎn)物。

    15N標記的L-胱氨酸是研究蛋白質(zhì)代謝的重要示蹤劑之一,目前國際上僅ISOTOPE等少數(shù)公司能提供產(chǎn)品,價格昂貴,售價高達每克4 640美元。因此開發(fā)15N標記L-胱氨酸的制備工藝具有較好的學術(shù)意義和經(jīng)濟效益。

    基于L-胱氨酸可在酸性溶液中還原為L-半胱氨酸,L-半胱氨酸也可在堿性環(huán)境中氧化為L-胱氨酸,本實驗擬設計一個新的合成路線合成15N-L-胱氨酸。元素分析儀:美國PE公司;LC-20AT高效液相色譜:日本島津公司;Thermo Finingan TSQ/A ccela質(zhì)譜儀:美國熱電公司;MAT-271氣體同位素質(zhì)譜計:西德菲尼根瑪特公司。

    15NH4Cl:上?;ぱ芯吭荷a(chǎn);鄰苯二甲酸、丙二酸二甲酯、芐硫醇、三聚甲醛等皆為市售化學純或分析純試劑。

    2 實驗方法

    總體合成路線設計為三步:第一步先合成S-芐基-D,L-半胱氨酸;第二步,采用酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸,包括對 S-芐基-D,L-半胱氨酸乙?;?、酶拆分和消旋化;第三步,對拆分后的S-芐基-D,L-半胱氨酸解保護,脫除芐基后再經(jīng)氧化得到L-胱氨酸。

    2.1 S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成

    1 主要儀器與試劑

    WRS-1數(shù)字熔點儀:上海精密儀器有限公司;Bruker biospin AC-P200型核磁共振儀:德國Bruker公司;Nicolet FT-IR 6770紅外吸收光譜儀:美國Nicolet公司;Perkin-Elmer 240C

    S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成采用經(jīng)過改進的Gabriel方法,其合成路線示于圖1。鄰苯二甲酸鉀鹽(1)與溴代丙二酸二甲酯縮合得到鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2),其鈉鹽(3)再與芐基氯甲硫醚(4)反應得到N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5),再經(jīng)水解得到S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)。

    圖1 S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成路線

    2.1.1 鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)的制備

    鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)的合成參考文獻[3-4]。將NaOH溶液緩慢滴加到26.75 g(0.50mol)NH 4 Cl中,生成的 NH 3隨 N2氣流通入由83.1 g(0.50 mo l)鄰苯二甲酸和200m L水配成的懸濁液中。待NH 3完全被鄰苯二甲酸溶液吸收后,先于100℃下蒸除溶液中的水,然后緩慢升溫至200℃脫水,最后將溫度逐漸上升至300℃,冷卻得白色固體74.1 g。將上述制得的鄰苯二甲酰亞胺粗品溶于無水乙醇,于攪拌下緩慢滴加KOH的無水甲醇溶液,室溫下保持3 h,過濾,用無水乙醇洗滌3次,得鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)白色晶體88.9 g,收率96.1%。

    2.1.2 鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)及其鈉鹽(3)的制備

    將18.52 g(0.1 mol)N-鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)與23.90 g(0.1m ol)新鮮制備的溴代丙二酸二乙酯均勻混合,在110℃油浴中加熱1 h,冷卻后加水攪拌,反應物變?yōu)楣腆w。將其轉(zhuǎn)移到研缽內(nèi)反復研磨,水洗抽濾后得到29.80 g(2),收率97.6%。將制得的產(chǎn)物(2)加熱溶解于100 m L甲苯中,加入2.75 g(0.12 mol)金屬鈉條,回流攪拌 3 h,沉淀經(jīng)甲苯洗滌,干燥,得30.7 g黃色產(chǎn)物(3),收率96.2%。

    2.1.3 芐基氯甲硫醚(4)的制備

    將49.7 g(0.40 mol)芐硫醇與40.5 g(0.45m ol)三聚甲醛在冰浴中冷卻,并用干燥過的HCl氣飽和,然后加入 70 g(0.63 m ol)CaCl2,再于室溫下保持24 h。過濾除去固體物質(zhì)后,母液用5 mol/L NaOH溶液洗滌3次,無水Na2 SO4干燥,過濾后,減壓(0.27 kPa)蒸餾,收集 102℃的餾分,得到芐基氯甲硫醚(4)21.1 g,收率30.5%。

    2.1.4 N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)的制備

    將5.00 g(0.015 3mol)鈉鹽(3)和2.70 g(0.015 6 mo l)芐基氯甲硫醚(4)和50 m L無水甲苯攪拌回流12 h,過濾。沉淀經(jīng)甲苯洗滌后,再用無水乙醇重結(jié)晶,得到產(chǎn)物(5)4.0 g,產(chǎn)率59.4%。產(chǎn)物(5)的熔點為79.5~80.4℃;1H NMR(CDCl3):1.28(t,6H,J=7.0 H z,—CH 3),3.55(s,2H, —C—CH 2—S—),3.70(s,2H,—S—CH2—A r),4.32(q,4H,J=7.0Hz,—OCH2—),7.10 ~ 7.27(m,5H,—C6H5),7.72~7.81(m,4H,—C6H4)。

    2.1.5 S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)的制備

    將4.0 g縮合產(chǎn)物(5)懸浮于25m L V(乙醇)∶V(水)=1∶1混合液中,于攪拌下逐滴加入20m L 5 mol/L NaOH,保持溫度55~60℃,攪拌1 h后,加入足量濃鹽酸酸化,加熱水解2 h后蒸干溶液,滴加少許NaOH溶液至溶液呈中性(剛果紅)。將得到的沉淀過濾,并懸浮于沸騰的95%乙醇中,趁熱過濾,冷卻后得到晶體狀S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)0.98 g,收率50.1%。產(chǎn)物(6)的熔點:211~214℃;元素分析實測值(計算值,%):C 56.80(56.87),N 6.58(6.63),H 6.15(6.20);MS-EI(m/z,%):211.1(M+,10),91.1(100);IR(υ/cm-1,KBr):3 062(C —H,A r—H),2 934(O—H,—COOH),1 500,1 588(C —C,benzene),1 400(C=O,—COOH)。

    2.2 氨基酰化酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸

    氨基?;阜ú鸱諷-芐基-D,L-半胱氨酸的化學過程示于圖2。

    圖2 氨基?;阜ú鸱諷-芐基-D,L-半胱氨酸的化學過程

    2.2.1 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的(7)的制備

    將6.0 g(0.028 4 mol)D,L-硫芐基半胱氨酸(6)溶于48m L 1 mol/LNaOH溶液中,于冰浴下逐滴滴加12 m L乙酸酐,保持2 h后,再用濃鹽酸酸化至pH 為2,經(jīng)抽濾、水洗、干燥,得到6.90 g白色固體(7),收率95.9%。熔點:158.7℃。

    2.2.2 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的拆分

    [5-8]對產(chǎn)物(7)進行拆分:將6.90 g(0.027 2m ol)上述制得的 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸溶于50 m L 1 mol/L NaOH溶液中,調(diào)節(jié)溶液的pH 約為8.0,將溫度控制在37℃,加入0.20 g氨基酰化酶,于輕微攪拌下保持30 h,再調(diào)節(jié)溶液的pH至5.5,4℃過夜,抽濾,洗滌后得到白色固體S-芐基-L-半胱氨酸(8),收率 82.6%。熔點:213.6℃,比旋光[α]D=+19.4°(NaOH 濃度為1mol/L,20 ℃)。

    2.2.3 N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸(8)的消旋

    參考文獻[9]進行消旋化:稱取3.0 g產(chǎn)物(8)溶于20 m L 2.5 m ol/L NaOH中,升溫至60~65℃,保溫1 h。逐滴加入20 m L乙酸酐,恒溫30m in,冷卻。用濃鹽酸將溶液酸化至pH=2,保持4℃過夜,沉淀物過濾烘干后用于二次拆分,可繼續(xù)得到白色固體(8)。經(jīng)二次拆分后,S-芐基-L-半胱氨酸(9)的拆分總收率為62%。

    2.3 15N-L-胱氨酸(11)的制備

    對N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸(9)進行解保護/氧化,制備L-胱氨酸,其化學過程示于圖3。

    圖3 對N-乙酰-S-芐基-L-半胱氨酸解保護/氧化得到L-胱氨酸的化學過程

    在-50 ℃下,將 3.5 g(0.016 5 m ol)產(chǎn)物(9)加入到50m L液氨中,再緩慢加入小塊金屬鈉,維持藍色3~5 min不褪,空氣中蒸發(fā)除去液氨,加入50 m L水;調(diào)pH 至8,加入痕量FeCl3,通入空氣流氧化;經(jīng)亞硝酸鐵氰化鈉檢測確定無硫醚后,過濾干燥。得白色固體(11)1.29 g,收率:78.0%。熔點:258℃。

    2.4 15N-L-胱氨酸的豐度實驗

    在上述實驗基礎(chǔ)上,以15NH 4 Cl(10.20%15N)為原料,進行L-胱氨酸合成的豐度驗證實驗,具體合成方法如前所述。

    3 結(jié)果與討論

    由于穩(wěn)定同位素15N原料非常昂貴,衡量合成路線優(yōu)劣的主要因素是穩(wěn)定同位素原子的利用率、產(chǎn)物的生物活性和同位素豐度。其中,經(jīng)Gabriel法改良的丙二酸酯法是15N標記氨基酸的重要合成方法。L-胱氨酸的巰基非?;顫?在合成過程中需對此加以保護??晒┻x擇的保護基有芐基、二苯甲基、三苯甲基等,其中芐基最為常用。因此,本工作采用芐基作為巰基保護基,將商業(yè)上較易獲得的芐硫醇引入,制得芐基氯甲硫醚,并作為合成前體。此外,經(jīng)化學合成方法得到的通常為消旋物,不具有光學活性,因此必須經(jīng)化學或酶法拆分得到L型產(chǎn)物,最后,再經(jīng)解保護過程脫除保護基,得到目標產(chǎn)物15N標記L-胱氨酸。

    3.1 S-芐基-D,L-半胱氨酸合成中的影響因素

    在15N-L-胱氨酸的合成過程中存在多個關(guān)鍵合成步驟,對最終產(chǎn)物的收率影響很大。

    3.1.1 反應溫度對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)收率的影響

    在產(chǎn)物(2)的合成過程中,保持其他條件不變,僅改變油浴溫度,觀察溫度對產(chǎn)物(2)收率的影響,結(jié)果列于表1。由表1可知,在實驗條件下,反應溫度對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的收率有較大影響,在110~120℃溫度范圍內(nèi)可獲得良好的收率。隨著溫度進一步升高(高于130℃),產(chǎn)物的熔程變寬,表明副產(chǎn)物增多,收率降低。

    3.1.2 反應時間對N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)收率的影響

    產(chǎn)物(5)的合成過程中,保持其他條件不變,僅改變反應時間,觀察反應時間對產(chǎn)物(5)收率的影響,結(jié)果列于表2。由表2可知,在實驗條件下,反應時間對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的收率有較大影響,隨著反應時間延長,產(chǎn)物收率顯著增加;12 h以后,進一步延長反應時間(16 h),反應收率不再有明顯變化,因此,該步反應時間以12 h為宜。

    表1 反應溫度對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)收率的影響

    表2 反應時間對N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)收率的影響

    3.1.3 水解時間對S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)收率的影響

    在探索實驗中發(fā)現(xiàn),N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的水解時間是影響S-芐基-D,L-半胱氨酸收率的重要因素。反應按2.1.5進行,在其他條件不變的情況下,只改變鹽酸水解的時間,考察水解時間對D,L-硫芐基半胱氨酸收率的影響,結(jié)果列于表3。由表3可知,隨著反應時間延長,產(chǎn)品收率上升,2 h時收率最高,達50%,此后隨著水解時間進一步延長,產(chǎn)品收率略有下降。因此,實際水解時間應控制在2 h。

    表3 水解時間對 S-芐基-D,L-半胱氨酸收率的影響

    3.2 氨基?;阜ú鸱諨,L-硫芐基半胱氨酸中的影響因素

    將所制得的S-芐基-D,L-半胱氨酸進行乙?;?并采用氨基?;笇ζ溥M行光學拆分,再將具有光學活性的S-芐基-L-半胱氨酸從拆分混合液中分離出來。為了提高拆分的收率,還需對未參與反應的N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸進行消旋化,進行再次拆分。

    在本研究過程中,先后通過單因素考察和正交實驗,對影響氨基?;阜ú鸱諲-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸生成S-芐基-L-半胱氨酸的多種影響因素進行了優(yōu)化,找到了比較合適的工藝條件[11]:反應物 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的量為5 g,pH為8.0,反應溫度為37℃,酶用量為200 m g,反應液總體積為50 m L,反應時間為30 h。在此條件下,S-芐基-L-半胱氨酸拆分的單程收率達到45%,N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸回收率達到88%。經(jīng)過兩次拆分以后,S-芐基-D,L-半胱氨酸總的拆分收率達到62%。

    3.3 保護基的脫除

    解保護即脫除S-芐基-L-半胱氨酸上的保護基芐基??晒┻x擇的體系有HF體系[10]和Na/NH3體系。HF體系收率較高(90%),但HF氣體毒性大,對于實驗裝置要求很高;Na/NH3體系收率相對較低(78%),操作相對容易,危險性較小。因此在實驗中選擇Na/NH3體系進行解保護。由于L-半胱氨酸在中性和堿性溶液中易被氧化生成 L-胱氨酸,且 L-胱氨酸難溶于水,因此在解保護后,在痕量Fe3+的催化下,于近中性溶液中將L-半胱氨酸氧化為L-胱氨酸。

    3.4 產(chǎn)品的分析與表征

    對于終產(chǎn)品進行紅外分析,結(jié)果示于圖4。根據(jù)圖 4可計算 IR(υ/cm-1,KBr)得:2 980(O —H,—COOH),1 680(C=O,—COOH),1 590(N—H,—NH2),1 480(C—H,—NH2—),1 400(C—O,—COOH),1 110(C—N,—CH—NH2)。薄層層析鑒定表明,產(chǎn)物與L-胱氨酸標樣具有相同的R f。比旋光度[α]D為-215°(c=1,1 m ol/L HCl,20 ℃),與標樣在該條件下的比旋光度-220°很接近。在HPLC上檢測產(chǎn)物純度大于98%。元素分析,C6H12N2S2O4實測值(計算值):C 29.82%(29.99%),N 11.59%(11.66%),H 6.15%(6.13%)。

    圖4 L-胱氨酸的紅外光譜

    3.5 15N-L-胱氨酸豐度實驗驗證

    通過優(yōu)化合成方法,以NH 4Cl和芐基氯甲硫醚為前體進行了L-胱氨酸的合成,總收率為13.9%,產(chǎn)物的化學純度和光學純度符合要求。在此基礎(chǔ)上,以15NH4Cl(10.20%15N)為標記前體,進行L-胱氨酸合成的豐度實驗,合成總收率13.5%,15N的豐度為10.18%,未出現(xiàn)同位素稀釋現(xiàn)象。

    4 小 結(jié)

    設計并完成了適合15N標記的L-胱氨酸,以15NH4 Cl為起始原料,通過改進的Gabriel方法得到S-芐基-D,L-半胱氨酸,再經(jīng)氨基?;阜ú鸱趾徒獬Wo后得到15N標記L-胱氨酸。紅外、HPLC質(zhì)譜、元素分析等分析手段均確證了多種中間體和15N標記L-胱氨酸的結(jié)構(gòu);以同位素原料計總產(chǎn)率為13.5%,所用工藝不會產(chǎn)生同位素稀釋,可以滿足商品化15N標記L-胱氨酸及相關(guān)衍生物的合成。

    參考文獻:

    [1] John W,Vincent V.A new synthesis of cystine[J].JBio Chem,1939,131(1):267-271.

    [2] Masatsune Kenichi U.Synthesis o f[1,1'-13C2]-L-cysteine[J].J Label Comp Radiopharm,1991,29(8):867-874.

    [3] 盛懷禹,陳耀煥,袁群,等.同位素有機化學[M].浙江:浙江教育出版社,1994:209-214.

    [4] Authur M,L loyd W.Organic syntheses w ith isotopes:partⅡ[M].New York:Interscience publishers,1958:1 776-1 788.

    [5] Yuan YJ,Wang SH,Song ZX,et al.Production of L-methionine by immobilized pellets of Aspergillus oryzae in a packed bed reactor[J].JChem Tech Bio,2002,77(6):602-606.

    [6] 張倩穎,張關(guān)永.S-芐基-L-半胱氨酸測定方法的研究[J].氨基酸和生物資源,2000,22(3):62-64.

    [7] 姚文兵,侯振清,吳梧桐,等.固定化牛腎氨基?;覆鸱址ㄖ苽銬-丙氨酸[J].中國藥科大學學報,2000,31(4):297-300.

    [8] 張清玉,譚欣,趙林,等.乙酰-D-氨基酸消旋工藝的研究[J].化學工業(yè)與工程,2004,21(2):91-95.

    [9] John W,Vincent V.Racem ization of benzy l-L-cysteine,with a new method of p reparing D-cystine[J].JBio Chem,1939,130(1):109-114.

    [10]Shumpei S,Yasutsugu S,Yasuo K,et al.Use of anhydrous hydrogen fluoride in peptide synthesis:I.Behavior of various perotective groups in anhydrous hydrpgen fluoride[J].Bu ll Chem Soc Japan,1967,40(9):2 164-2 167.

    [11] 柯昌武,羅勇,潘潔,等.酶法拆分15N標記 S-芐基-半胱氨酸的研究[J].上海化工,2009,34(10):7-11.

    猜你喜歡
    丙二酸胱氨酸硫醚
    基于分子蒸餾的丙硫醚提純工藝研究
    山西化工(2023年10期)2023-11-15 08:47:42
    丙二酸合成工藝探究
    石墨相氮化碳納米片負載胱氨酸醌的合成、表征及其對痕量Cd2+和Pb2+的去除*
    胱氨酸貯積癥診療進展
    頭發(fā)是怎么被燙彎的
    為什么海風有腥味?
    百科知識(2016年18期)2016-10-28 00:20:12
    丙二酸的合成與應用
    山東化工(2016年4期)2016-09-05 12:30:54
    甲基丙二酸血癥合并肺動脈高壓1例的護理
    第2代測序技術(shù)在甲基丙二酸尿癥以及苯丙酮尿癥診斷中的應用
    依巴斯汀聯(lián)合胱氨酸、鹵米松治療斑禿療效觀察
    美女视频免费永久观看网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 97精品久久久久久久久久精品| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久久久久久人人人人人人| 嘟嘟电影网在线观看| 天美传媒精品一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 97超碰精品成人国产| 成人二区视频| 丝袜美腿在线中文| 免费av毛片视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 舔av片在线| av在线观看视频网站免费| 国产在线男女| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲性久久影院| 99热全是精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 深夜a级毛片| 三级经典国产精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线 av 中文字幕| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美性感艳星| 亚洲成人av在线免费| 日日啪夜夜爽| 97精品久久久久久久久久精品| 日本av手机在线免费观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 99视频精品全部免费 在线| 免费黄网站久久成人精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲av男天堂| 中文字幕av成人在线电影| 日本免费在线观看一区| 人妻 亚洲 视频| 国产精品一二三区在线看| 国产精品久久久久久av不卡| 国产男人的电影天堂91| 午夜福利网站1000一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 午夜激情福利司机影院| 青青草视频在线视频观看| 亚洲美女视频黄频| 男女啪啪激烈高潮av片| 成人免费观看视频高清| 好男人视频免费观看在线| 久久久午夜欧美精品| 久久久久久久久久成人| 99热全是精品| 春色校园在线视频观看| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩伦理黄色片| 我的老师免费观看完整版| 在线看a的网站| 看免费成人av毛片| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久久网色| 久久久久久久精品精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人精品福利久久| 日韩电影二区| 香蕉精品网在线| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 男女边摸边吃奶| 尾随美女入室| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品嫩草影院av在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 99久久精品热视频| 日韩一本色道免费dvd| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产淫语在线视频| 亚洲人成网站在线播| 少妇熟女欧美另类| 一级毛片我不卡| 听说在线观看完整版免费高清| 又大又黄又爽视频免费| 久久精品人妻少妇| 黄色日韩在线| 日韩成人伦理影院| 久久久a久久爽久久v久久| 成人二区视频| 国产 精品1| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产在线一区二区三区精| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 日本熟妇午夜| 国产伦在线观看视频一区| 男人添女人高潮全过程视频| 久久精品国产a三级三级三级| 99热全是精品| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩亚洲欧美综合| 国产高清有码在线观看视频| 久久久久久久午夜电影| 少妇人妻 视频| 免费看a级黄色片| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久久久久久久久久免费av| 久久久久久久久久成人| 国产成人午夜福利电影在线观看| 免费少妇av软件| 久久精品久久久久久久性| 午夜爱爱视频在线播放| videossex国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧洲日产国产| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美区成人在线视频| 十八禁网站网址无遮挡 | 高清日韩中文字幕在线| 亚洲天堂av无毛| eeuss影院久久| 免费观看a级毛片全部| 欧美日韩在线观看h| av播播在线观看一区| 身体一侧抽搐| 熟女电影av网| 免费黄网站久久成人精品| 成年免费大片在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 老司机影院成人| 久久久久网色| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男男h啪啪无遮挡| 黄色怎么调成土黄色| 舔av片在线| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美另类一区| 丰满乱子伦码专区| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲精品,欧美精品| 大陆偷拍与自拍| 九草在线视频观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产中年淑女户外野战色| 国产视频首页在线观看| 成人特级av手机在线观看| 男女国产视频网站| 97超视频在线观看视频| 日韩欧美 国产精品| 午夜精品国产一区二区电影 | 夜夜爽夜夜爽视频| 九九爱精品视频在线观看| 午夜老司机福利剧场| 国产视频首页在线观看| 少妇的逼好多水| 久久久久久久午夜电影| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 26uuu在线亚洲综合色| 精品久久久久久久久亚洲| 日本午夜av视频| 美女主播在线视频| 日韩伦理黄色片| 精品人妻视频免费看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男的添女的下面高潮视频| 成人毛片60女人毛片免费| 成人亚洲欧美一区二区av| 黄色一级大片看看| 少妇高潮的动态图| 女人久久www免费人成看片| 在线精品无人区一区二区三 | 中文字幕制服av| 又爽又黄无遮挡网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费黄色在线免费观看| 色视频www国产| 欧美3d第一页| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 好男人视频免费观看在线| 亚洲色图综合在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲va在线va天堂va国产| 高清欧美精品videossex| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲av不卡在线观看| 婷婷色av中文字幕| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美3d第一页| 欧美极品一区二区三区四区| 高清毛片免费看| videos熟女内射| videos熟女内射| 男女无遮挡免费网站观看| 可以在线观看毛片的网站| 久久久欧美国产精品| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲三级黄色毛片| 99热这里只有是精品50| 国产一区有黄有色的免费视频| 观看免费一级毛片| 日本一本二区三区精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人精品一,二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲av二区三区四区| 国产午夜福利久久久久久| av网站免费在线观看视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成人黄色视频免费在线看| 草草在线视频免费看| 国产男人的电影天堂91| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产男女内射视频| 身体一侧抽搐| 高清午夜精品一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 国产极品天堂在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99热网站在线观看| 亚洲国产欧美人成| av国产精品久久久久影院| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲精品第二区| 99热这里只有精品一区| 精品一区二区三卡| 久久久久久久久久成人| 黄色日韩在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 九色成人免费人妻av| 一级毛片久久久久久久久女| 禁无遮挡网站| 日韩一区二区三区影片| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 欧美日韩综合久久久久久| freevideosex欧美| 看非洲黑人一级黄片| 日韩三级伦理在线观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 欧美丝袜亚洲另类| 天堂俺去俺来也www色官网| 啦啦啦啦在线视频资源| 新久久久久国产一级毛片| 男女无遮挡免费网站观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 少妇的逼好多水| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一本一本综合久久| 国产69精品久久久久777片| 丝袜喷水一区| 麻豆成人av视频| 免费观看在线日韩| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久人人爽人人爽人人片va| 在线观看国产h片| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久久久性生活片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 女人久久www免费人成看片| 男的添女的下面高潮视频| 日本午夜av视频| 国产男人的电影天堂91| 深爱激情五月婷婷| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色视频在线播放观看不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲三级黄色毛片| 色综合色国产| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 黄色视频在线播放观看不卡| 如何舔出高潮| 久久久精品免费免费高清| 看十八女毛片水多多多| 男女啪啪激烈高潮av片| 99久久精品热视频| 国产高清国产精品国产三级 | 午夜激情久久久久久久| 久久影院123| 亚洲国产色片| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲在久久综合| 交换朋友夫妻互换小说| 草草在线视频免费看| 欧美一区二区亚洲| 久久午夜福利片| 少妇熟女欧美另类| 亚洲精品一区蜜桃| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产午夜福利久久久久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜激情久久久久久久| av国产精品久久久久影院| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| av国产免费在线观看| av一本久久久久| 老司机影院成人| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av又黄又爽大尺度在线免费看| 综合色丁香网| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 日日啪夜夜爽| 搞女人的毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美一区二区亚洲| 久久精品夜色国产| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色5月婷婷丁香| 久久99精品国语久久久| 51国产日韩欧美| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产淫语在线视频| h日本视频在线播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 在线观看国产h片| 久久精品夜色国产| 欧美潮喷喷水| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一区二区av电影网| 视频中文字幕在线观看| 亚洲精品第二区| 亚洲三级黄色毛片| 久久久久久久久久人人人人人人| 免费观看a级毛片全部| 色哟哟·www| 男人和女人高潮做爰伦理| 新久久久久国产一级毛片| 大香蕉久久网| 精品人妻视频免费看| 视频中文字幕在线观看| 国产美女午夜福利| 成人一区二区视频在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 在线观看一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件| 最近的中文字幕免费完整| 久久久精品免费免费高清| 成人毛片60女人毛片免费| 少妇人妻 视频| 综合色丁香网| 欧美丝袜亚洲另类| 91狼人影院| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美另类一区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久精品国产亚洲av天美| 岛国毛片在线播放| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产在线男女| 日韩av在线免费看完整版不卡| 高清av免费在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 97热精品久久久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 网址你懂的国产日韩在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产免费视频播放在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| www.av在线官网国产| 视频区图区小说| 丝袜美腿在线中文| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲最大成人中文| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 91精品国产九色| 国产探花极品一区二区| 亚洲天堂av无毛| 免费观看无遮挡的男女| 欧美极品一区二区三区四区| 色综合色国产| 久久99热这里只有精品18| 能在线免费看毛片的网站| 涩涩av久久男人的天堂| 国产黄片美女视频| 久久久亚洲精品成人影院| 日本与韩国留学比较| 亚洲av欧美aⅴ国产| 22中文网久久字幕| 最近中文字幕2019免费版| 国产中年淑女户外野战色| 国产老妇伦熟女老妇高清| tube8黄色片| 免费观看在线日韩| 少妇的逼好多水| 水蜜桃什么品种好| 国产在线男女| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲图色成人| 在线天堂最新版资源| 在线观看国产h片| 欧美3d第一页| 岛国毛片在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 插阴视频在线观看视频| 观看免费一级毛片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品三级大全| 成年免费大片在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 又大又黄又爽视频免费| 成人无遮挡网站| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 综合色丁香网| 亚洲精品一区蜜桃| av在线蜜桃| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品一区二区在线观看99| 久久久久久久久大av| 午夜福利视频1000在线观看| 久久这里有精品视频免费| 国产亚洲5aaaaa淫片| 欧美激情在线99| 亚洲av成人精品一区久久| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精品久久午夜乱码| 丝瓜视频免费看黄片| 国产免费福利视频在线观看| 视频中文字幕在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 边亲边吃奶的免费视频| 中国国产av一级| 国产亚洲一区二区精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 少妇人妻 视频| 春色校园在线视频观看| 赤兔流量卡办理| 深夜a级毛片| 91久久精品国产一区二区成人| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一二三四中文在线观看免费高清| 观看免费一级毛片| 精品国产三级普通话版| 国产成人免费无遮挡视频| 99热这里只有精品一区| .国产精品久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国内精品宾馆在线| 青春草视频在线免费观看| 国产一区二区三区av在线| 插阴视频在线观看视频| 99久久精品一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 日韩欧美精品免费久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看免费成人av毛片| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲欧美精品专区久久| 丝袜美腿在线中文| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧洲国产日韩| 少妇 在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 舔av片在线| 丝袜喷水一区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久网色| 日本熟妇午夜| 国产成人福利小说| 内地一区二区视频在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 大片免费播放器 马上看| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av.av天堂| 午夜激情福利司机影院| 久久久久久久久久人人人人人人| 日韩强制内射视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品人妻视频免费看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲最大成人中文| 亚洲欧洲日产国产| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 伦精品一区二区三区| 色吧在线观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲电影在线观看av| av国产精品久久久久影院| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 97精品久久久久久久久久精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久久久久久午夜电影| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品无大码| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲av免费高清在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产av不卡久久| 99热这里只有精品一区| 久久久午夜欧美精品| 最近手机中文字幕大全| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品色激情综合| 久久久久久久国产电影| 久久久亚洲精品成人影院| 性色avwww在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一级片'在线观看视频| 99热这里只有精品一区| 国产精品国产三级专区第一集| 男插女下体视频免费在线播放| 免费大片黄手机在线观看| 男女国产视频网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美bdsm另类| a级毛色黄片| 欧美精品一区二区大全| 一区二区三区乱码不卡18| 黄色一级大片看看| 成人漫画全彩无遮挡| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 99久久精品热视频| 国产精品伦人一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 大香蕉97超碰在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 91久久精品国产一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 少妇人妻 视频| 超碰97精品在线观看| 男人舔奶头视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲图色成人| 久久国产乱子免费精品| 青春草国产在线视频| 男的添女的下面高潮视频| 国产亚洲精品久久久com| 大陆偷拍与自拍| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲在久久综合| 在线观看美女被高潮喷水网站| 18+在线观看网站| 久久久久久久午夜电影| 国产高清三级在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品一区蜜桃| 一区二区av电影网| 国产爽快片一区二区三区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 99热这里只有是精品在线观看| 国产黄色免费在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 中文天堂在线官网| 在现免费观看毛片| 国产免费福利视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 日本免费在线观看一区| 水蜜桃什么品种好| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲av不卡在线观看| 一级毛片 在线播放| 男女那种视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 高清日韩中文字幕在线| 日日啪夜夜爽| 久久99热这里只有精品18| 99久久人妻综合| 久久久久久久久大av| 新久久久久国产一级毛片| 日日撸夜夜添| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 禁无遮挡网站| 制服丝袜香蕉在线| 日本欧美国产在线视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 在线 av 中文字幕| 国产永久视频网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 婷婷色麻豆天堂久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 2022亚洲国产成人精品| 如何舔出高潮| 欧美bdsm另类| 直男gayav资源|