PET腫瘤顯像劑18F-氟乙基膽堿的自動(dòng)化合成

黨永紅,李 方,呂京橋,邢海群

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,北京 100730)

2-18F-2-脫氧-D-葡萄糖(FDG)是目前 PET最常用的反映細(xì)胞糖代謝的腫瘤顯像劑,但18FFDG存在特異性較差、有時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性、不能區(qū)分腫瘤和炎癥等缺點(diǎn),在某些腦腫瘤、肺癌、前列腺癌等的診斷和鑒別中存在很多困難。為彌補(bǔ)18F-FDG不足,研究人員致力于新腫瘤顯像劑的研究。

膽堿是所有細(xì)胞用于生物合成磷脂的前體,而磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分。腫瘤的特點(diǎn)是細(xì)胞增殖快,迅速增生的腫瘤組織增加了對(duì)膽堿的需求。因此膽堿也成為一類(lèi)重要的代謝顯像劑。11C-膽堿作為第一個(gè)膽堿類(lèi)顯像劑,已成功應(yīng)用于腦腫瘤、肺癌、食管癌、結(jié)腸癌以及前列腺癌等惡性腫瘤診斷[1-2]。但11C的半衰期短,只有20 min,只能在配備加速器的單位使用,這就推動(dòng)了具有較長(zhǎng)半衰期的18F(t1/2=109 min)標(biāo)記的膽堿類(lèi)顯像劑的發(fā)展[3-7]。研究[8-9]表明,18F標(biāo)記的膽堿類(lèi)似物在腦腫瘤的診斷中顯示出良好的應(yīng)用前景。其中18F-氟乙基膽堿(18F-FECH)與11C-膽堿的體內(nèi)分布相似,且在前列腺癌患者體內(nèi)獲得了良好的顯像結(jié)果[7]。在德國(guó),18F-FECH用于診斷前列腺癌已進(jìn)入了三期臨床階段[10];而國(guó)內(nèi),18F-FECH在北京協(xié)和醫(yī)院已通過(guò)倫理委員會(huì)的審批,進(jìn)入備案前的臨床試驗(yàn)階段。

吳戰(zhàn)宏等[11]曾成功合成18F-FECH,但其合成時(shí)間較長(zhǎng)且收率較低。PET-MF-2V-IT-I型18F多功能合成模塊是商品化的用于研制、生產(chǎn)18F標(biāo)記化合物的合成裝置,它通過(guò)計(jì)算機(jī)控制,可依據(jù)需要按手動(dòng)、自動(dòng)和半自動(dòng)方式合成多種常規(guī)和復(fù)雜的18F標(biāo)記物。模塊的使用不僅可簡(jiǎn)化操作,而且也有利于輻射防護(hù)。為了保證臨床試驗(yàn)工作的順利進(jìn)行并推廣18F-FECH的臨床應(yīng)用,本工作擬利用現(xiàn)有的模塊,進(jìn)行18F-FECH的自動(dòng)化合成研究,建立一種通用的自動(dòng)化合成方法。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 試劑與材料

1,2-乙二醇二對(duì)甲苯磺酸酯(純度＞97%)和無(wú)水K2CO3(純度99.995%):美國(guó)A ld rich公司產(chǎn)品;N,N-二甲基乙醇胺(純度≥98%):美國(guó)Fluka公司產(chǎn)品;無(wú)水乙腈(純度99.9%)和K2.2.2(純度 98%):比利時(shí) Acros公司產(chǎn)品;HPLC乙腈(色譜純):瑞士 Fisher公司產(chǎn)品。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。QMA(Sep-pak Light)、C18(Sep-Pak Plus)、CM 柱(Sep-Pak Plus):美國(guó) Waters公司產(chǎn)品;Adsorbosphere SCX色譜柱(5μm,4.6 mm ×250 mm):美國(guó)A lltech公司產(chǎn)品,60F254薄層層析硅膠板:德國(guó)Merck公司產(chǎn)品;Millex-GS 0.22μm除菌過(guò)濾器:美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

RDS111型回旋加速器:美國(guó) CTI公司產(chǎn)品;PET-MF-2V-IT-I型18F正電子藥物合成模塊:北京派特生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;高效液相色譜儀:配515型泵,美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;486型高效液相色譜紫外檢測(cè)器:美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;高效液相色譜放射性檢測(cè)器:美國(guó)Bio-Scan公司產(chǎn)品;Mini-Scan和F low Counter:美國(guó)Bio-Scan公司產(chǎn)品;CRC-15R型放射性活度計(jì):美國(guó)CAPINTEC公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 合成模塊

PET-MF-2V-IT-I型18F多功能合成模塊結(jié)構(gòu)示意圖示于圖1。根據(jù)18F-FECH的合成路線(xiàn)與處理方式編寫(xiě)了合成控制程序。

2.2 18F-FECH的自動(dòng)化合成

18F-FECH的自動(dòng)化合成路線(xiàn)示于圖2。由圖2可知,18F與1,2-乙二醇二對(duì)甲苯磺酸酯反應(yīng)生成中間體18F-氟乙基對(duì)甲苯磺酸酯,中間體再與N,N-二甲基乙醇胺發(fā)生烷基化反應(yīng)得到18F-FECH,經(jīng)過(guò)C18和CM 柱分離純化得到最終產(chǎn)品。

具體反應(yīng)過(guò)程如下。

(1)1號(hào)瓶中的1.5 m L STOCK溶液(K2.2.2 13 g/L,K2 CO3 3 g/L)將富集在 QMA柱上的18F-淋洗至1號(hào)反應(yīng)管(RV 1)中,加熱至116℃下蒸干溶液。

(2)將2號(hào)瓶中的2 m L無(wú)水乙腈加入到RV 1中,加熱至116℃,蒸干溶液,冷卻。

(3)將3號(hào)瓶中的液體(12 mg 1,2-乙二醇二對(duì)甲苯磺酸酯溶于0.8 m L無(wú)水乙腈)加入RV 1中,于90℃下反應(yīng)5m in。升溫至115℃,蒸除溶劑。

圖1 18F多功能合成模塊結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 18F-FECH的自動(dòng)化合成路線(xiàn)

(4)冷卻RV 1后加入4號(hào)瓶中的0.3 m L N,N-二甲基乙醇胺,100℃下反應(yīng)8m in,冷卻。

(5)向RV 1中加入5號(hào)瓶中的2 m L去離子水,經(jīng)過(guò) C18柱轉(zhuǎn)移至第二個(gè)反應(yīng)管(RV 2)中。

(6)將RV 2中的液體轉(zhuǎn)移至CM柱上,洗出液引入廢液瓶。

(7)加入12號(hào)瓶中的10 m L乙醇至RV 2中,清洗CM柱。

(8)將6號(hào)瓶中的20m L滅菌注射用水轉(zhuǎn)移至11號(hào)瓶中,然后加入到RV 2中,再次清洗CM柱。

(9)將13號(hào)瓶中的5m L生理鹽水加入到RV 2中,將CM 柱上的產(chǎn)品洗脫下來(lái),洗脫液經(jīng)過(guò)0.22μm除菌過(guò)濾器收集在30m L無(wú)菌產(chǎn)品瓶中,得到無(wú)色澄明的18F-FECH注射液。

2.3 產(chǎn)品的質(zhì)量控制

(1)目測(cè)產(chǎn)品的顏色及澄明度,用精密pH試紙測(cè)定pH。

(2)采用高效液相色譜(HPLC)法和薄層層析(TLC)法檢測(cè)產(chǎn)品的放化純度。HPLC法的色譜條件為:V(0.25 mol/L磷酸二氫鈉溶液)∶V(乙腈)=90∶10為流動(dòng)相,流速為1.0m L/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm。TLC法所用展開(kāi)劑為5%乙酸溶液。

(3)檢測(cè)產(chǎn)品中K2.2.2的含量。采用薄層層析法,V(甲醇)∶V(氨水)=9∶1為展開(kāi)劑,碘鉑酸鉀顯色。

(4)參照中國(guó)藥典2005年版二部附錄ⅪE進(jìn)行無(wú)菌和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

(5)室溫下測(cè)定3個(gè)半衰期內(nèi)(6 h)的放化純度,觀(guān)察其穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-FECH的自動(dòng)化合成

整個(gè)自動(dòng)化合成過(guò)程需時(shí)約40 m in,產(chǎn)品的放化收率為30%(未經(jīng)時(shí)間校正)。與文獻(xiàn)[6-7,11-16]中其他應(yīng)用模塊合成的結(jié)果相比,反應(yīng)時(shí)間和放化收率差于Pascali等[16]的方法,而要好于其它幾種方法。提示反應(yīng)的條件和參數(shù)還可以進(jìn)一步優(yōu)化,從而在更短的時(shí)間里得到更高放化收率的產(chǎn)品。

本方法采用了兩步反應(yīng)在同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行的方法。文獻(xiàn)中單管反應(yīng)產(chǎn)品純化采用的方法有兩種:一種是相對(duì)比較煩瑣的HPLC法,另一種是比較簡(jiǎn)便的固相萃取法。唐剛?cè)A[12]和王明偉等[15]使用硅膠柱進(jìn)行純化,但合成時(shí)間較長(zhǎng)(80min和65m in),且收率相對(duì)較低。本工作也對(duì)此純化方法進(jìn)行過(guò)比較,結(jié)果顯示,用水清洗硅膠柱不能完全除去N,N-二甲基乙醇胺;分別用乙醇和水清洗(至產(chǎn)品中聞不到N,N-二甲基乙醇胺的氣味),則放化收率約為20%(未經(jīng)時(shí)間校正)。故本工作采用了C18柱和CM柱對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行固相萃取分離。

3.2 C18柱對(duì)合成效率的影響

CM柱是弱的陽(yáng)離子交換柱,可以吸附18FFECH,從而達(dá)到純化目的。單管反應(yīng)時(shí),氟代反應(yīng)中碳酸鉀中鉀離子的存在對(duì)CM吸附最終產(chǎn)品的影響很大,常常會(huì)造成產(chǎn)品在CM柱上的漏穿。本工作在CM柱前加了C18柱。在相同的反應(yīng)條件下,C18柱對(duì)合成效率的影響列于表1。從表1可以看出,在相同的反應(yīng)條件下,不用C18柱的合成效率只有5%～8%,僅為采用C18柱的1/4,說(shuō)明有大部分產(chǎn)品從CM柱上漏穿。因此C18柱不僅可以去除未反應(yīng)的1,2-乙二醇二對(duì)甲苯磺酸酯及反應(yīng)中間體18F-氟乙基對(duì)甲苯磺酸酯,而且可以吸附與K2.2.2絡(luò)合的鉀離子,是保證合成效率的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)過(guò)C18柱的純化后,CM柱只能吸附最終產(chǎn)品,用乙醇和水可以將未反應(yīng)的N,N-二甲基乙醇胺及18F-等其他雜質(zhì)沖洗掉,生理鹽水淋洗后即得最終產(chǎn)品。

表1 C18柱對(duì)合成效率的影響

3.3 18F-FECH注射液的質(zhì)量控制

(1)所得產(chǎn)品為無(wú)色澄明液體,pH為7.0～8.0。

(2)產(chǎn)品18F-FECH的HPLC和TLC譜圖分別示于圖3和圖4。由圖3可以看出,產(chǎn)品的保留時(shí)間為4.21 min,FECH標(biāo)準(zhǔn)品[11]的保留時(shí)間為4.03 min,即產(chǎn)品的放射性吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收峰的保留時(shí)間一致,表明18F標(biāo)記FECH后沒(méi)有改變FECH的化學(xué)結(jié)構(gòu)。由圖4可見(jiàn),產(chǎn)品只有唯一的放射性吸收峰,根據(jù)此峰可計(jì)算得18F-FECH放化純度＞99%。

(3)顯色后,樣品斑點(diǎn)的顏色不比濃度為25m g/L的K2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的斑點(diǎn)顏色深。說(shuō)明產(chǎn)品中的K 2.2.2含量小于25mg/L。

(4)產(chǎn)品的細(xì)菌及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

(5)圖 5為18F-FECH室溫放置6 h后的HPLC色譜圖。由圖5可以看出,產(chǎn)品的放化純度沒(méi)有明顯變化,仍大于98%。表明產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好。

以上結(jié)果說(shuō)明本方法所合成的18F-FECH注射液符合放射性藥物的質(zhì)量要求,可安全用于臨床。

圖3 18F-FECH注射液的 UV和HPLC重迭譜圖

圖4 18F-FECH注射液的TLC譜圖(R f=0.22)

圖5 18F-FECH注射液室溫放置6 h后的HPLC色譜圖

4 結(jié) 論

本工作利用PET-MF-2V-IT-I型18F多功能合成模塊自動(dòng)化合成了18F-FECH,合成時(shí)間為40min,產(chǎn)品的放化收率為30%(未經(jīng)時(shí)間校正),放化純度大于99%,穩(wěn)定性好,其余各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。該自動(dòng)化合成方法簡(jiǎn)便快速,為臨床診斷工作提供了有力的保證。在今后的工作中需進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件和參數(shù),使該方法更加完善。

致謝:感謝北京派特生物技術(shù)有限公司楊建華工程師在模塊使用中給予的指導(dǎo)與幫助。

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