基于碳納米管修飾石墨電極測定槲皮素

劉登友，羅啟枚，王輝憲，周 華

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，湖南長沙410128）

0 引言

槲皮素（Quercetin，Qu）是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，具有很高的藥用價(jià)值。它具有較好的祛痰止咳平喘作用，還具有降低血壓，增強(qiáng)毛細(xì)管抵抗力及降血脂的作用，對冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用[1]，此外還具有抗腫瘤、抗炎、抗衰老等廣泛的藥理作用[2～4]。目前對槲皮素的測定方法主要有：高效液相色譜法[5～6]、高效毛細(xì)管電泳法[7]、紫外光度法[8]、熒光光度法[9]、卡爾曼濾波光度法[10]、極譜法[11]、電化學(xué)方法等。

雖然色譜法測定槲皮素應(yīng)用較廣，但該方法繁瑣、儀器昂貴、尤其不便現(xiàn)場測試。而電化學(xué)方法（尤其是結(jié)合化學(xué)修飾電極）具有靈敏度高、分析速度快、儀器低廉、操作簡便和成本低廉的特性，有望實(shí)現(xiàn)對飲料、食品等樣品中的槲皮素進(jìn)行實(shí)時在線檢測。近年來，電化學(xué)在對槲皮素的測定方法研究中備受關(guān)注[12～13]。

碳納米管（CNTs）是1991年發(fā)現(xiàn)的一種碳的新型結(jié)構(gòu)，具有明顯的量子效應(yīng)、高的比表面積、高的穩(wěn)定性、強(qiáng)的吸附特性以及優(yōu)良的電催化性能等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為化學(xué)修飾電極和電化學(xué)生物傳感器等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[14～15]。

該文首次以石墨為基體，采用化學(xué)氣相沉積法直接生長于石墨基體上的碳納米管修飾電極（CNTs/C），對槲皮素進(jìn)行檢測研究，發(fā)現(xiàn)該電極制備簡單、響應(yīng)快、能夠用于槲皮素的測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

760C型電化學(xué)工作站 （上海辰化儀器有限公司）；MEC-12B型攪拌器 （江蘇江分電分析儀器有限公司）；測試系統(tǒng)；三電極體系：碳納米管修飾石墨電極(CNTs/C)為工作電極，飽和的甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑電極（Pt）為輔助電極。碳納米管的制備參照文獻(xiàn)[16]：利用化學(xué)氣相沉積法直接生長在以石墨（長 1.7 cm，寬 1.0 cm，高0.5 cm）為基體上；槲皮素（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）：用無水乙醇配制成1.0×10-2mol/L的溶液，備用。蘆丁（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、布列頓－羅賓遜廣泛緩沖液 （B-R）：用正磷酸、乙酸、硼酸、氫氧化鈉配制成不同的pH值；實(shí)驗(yàn)用水都是二次蒸餾水。

1.2 CNTs/C修飾電極的制備

首先以過渡金屬鐵作為催化劑，將其電鍍在石墨基體上，分別以N2、H2作為稀有氣體和保護(hù)氣體，以化學(xué)性質(zhì)較活潑的含有不飽和鍵的C2H2作為碳源，使C2H2在高溫狀態(tài)下裂解得到碳納米管，制備出直接生長于石墨基體上的碳納米管。然后將制備好的CNTs依次用30%的硝酸浸泡10 h，用二次蒸餾水清洗，晾干后再用玻璃膠固定在銅導(dǎo)線上，室溫干燥，即得碳納米管修飾石墨（CNTs/C）電極。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用三電極體系，以修飾電極為工作電極，飽和的甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑電極（Pt）為輔助電極。 以 B-R 緩沖溶液（pH1.81）為支持電解質(zhì)，采用循環(huán)伏安法（CV法，掃速為100 mV/s）對槲皮素的電化學(xué)行為進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素（Qu）在CNTs/C電極上的循環(huán)伏安曲線（CV曲線）

槲皮素在CNTs/C電極上的循環(huán)伏安曲線（CV）圖（圖1）。

圖1 槲皮素在CNTs/C上的CV曲線(循環(huán)2次)圖Fig.1 Cyclic voltammograms of 0.01mmol/L Qu at CNTs/C(two circles)The scan rate is 100 mV/s； enrichment time is 900 s；pH is 1.81

由圖1 可見，第一次循環(huán)分別在 0.53 V、0.63 V處呈現(xiàn)了兩個氧化峰，峰1和峰2。反向掃描時，在0.47 V處出現(xiàn)了一個較為明顯的還原峰3與氧化峰 1對應(yīng)，ΔE1=60 mV；在 0.56 V 處出現(xiàn)了一個不太明顯且峰形較寬的還原峰4與氧化峰2對應(yīng)，ΔE2=70 mV，顯示出可逆反應(yīng)的性質(zhì)。氧化峰1的峰形最好、峰電流最大，是槲皮素的主氧化峰。一般認(rèn)為在槲皮素的5個羥基中，B環(huán)上的兒茶酚3，4-雙羥基供電子基團(tuán)具有很高的電活性[17]，能夠在較低的電勢下被氧化并顯示較高的峰電流，所以氧化峰1的反應(yīng)式可能如圖2所示。

氧化峰1與還原峰3對應(yīng)，氧化峰2與還原峰4對應(yīng)。文獻(xiàn)[18]指出，氧化峰2在蘆丁的電氧化過程中沒有出現(xiàn)，所以應(yīng)歸屬于槲皮素的3-羥基的氧化（蘆丁的C-3位上是沒有電活性的蘆丁糖苷，其它結(jié)構(gòu)與槲皮素相同）。

2.2 底液和pH的影響

分 別 以 0.10 mol/L 的 NaC1、NaAc、KNO3、Na2SO4、Na2HPO4-NaH2PO4和B-R為支持電解質(zhì)，研究其對修飾電極的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在B-R緩沖溶液中，修飾電極具有良好的電化學(xué)行為。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇B-R溶液為支持電解質(zhì)。

圖2 氧化峰1的反應(yīng)式Fig.2 The oxidation peak 1 of the reaction

考察了介質(zhì) pH(1.50～6.80)對該修飾電極電化學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體系pH＜1.60和pH＞2.50時，修飾電極的電化學(xué)行為較差，峰電流較小。當(dāng)pH為1.81左右時，峰電流響應(yīng)值大且穩(wěn)定，電極表現(xiàn)出良好的電化學(xué)行為。因此，實(shí)驗(yàn)選用pH1.81的B-R緩沖溶液。

2.3 掃描速度的影響

用循環(huán)伏安法研究了槲皮素與掃描速度的關(guān)系。圖3是在不同掃描速度下測得的CV曲線。由圖可以看出，槲皮素在CNTs/C電極上，氧化峰電流ipa1，ipa2隨著掃描速度的增大而增大。當(dāng)掃描速度較慢時，ipa1＜ipa2。并且隨著掃描速度的增加，氧化峰1峰電流的增長速度比氧化峰2要快。從圖中還可以看出峰電流隨掃描速度的增大而線性增加，表明Qu在CNTs/C修飾電極上的氧化過程及電子遷移受到吸附作用的控制。另外，還可以發(fā)現(xiàn)，兩個氧化峰電位隨掃描速度的增大而正移。然而，當(dāng)掃描速度過高時，基線噪聲增大且峰形變差，速度大于400 mV/s時氧化峰2幾乎消失，當(dāng)掃描速度為100 mV/s時，信噪比（S/N）最好，因此，實(shí)驗(yàn)選擇掃描速度為100 mV/s。

圖3 槲皮素的各掃描速度循環(huán)伏安曲線圖Fig.3 CV curves of 0.01mmol/L Qu at CNTs/C with different scan rates The scan rate is respectively(arrow direction):10，20，50， 100， 200，300，400，500 mV/s

2.4 富集時間的影響

圖4是槲皮素在不同富集時間的循環(huán)伏安曲線圖，由圖可以發(fā)現(xiàn)，隨著富集時間的延長，槲皮素的各個峰電流明顯增大。當(dāng)富集時間從30 s延長至900 s時，峰電流隨富集時間的延長在增大，表明碳納米管具有很大的比表面積，且對槲皮素具有很強(qiáng)的吸附作用。 當(dāng)富集時間延長到1 800 s時，峰電流基本上與900 s時重合，到3 600 s時，達(dá)到吸附平衡。因此，從峰電位差、峰電流、峰形及檢測周期長短綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇富集時間為900 s。

2.5 循環(huán)伏安法檢測槲皮素

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法考察了5.0×10-8～5.0×10-4mol/L 不同濃度下槲皮素的CV曲線。從圖5中可以看出：分別在0.53 V和0.63 V處出現(xiàn)了氧化峰 1和氧化峰 2，在 0.47 V、0.56 V處出現(xiàn)了兩個與之相對應(yīng)的還原峰3和還原峰4。并且隨著槲皮素濃度的增大，氧化峰、還原峰的電流不斷增大。 在 1.0×10-7～5.0×10-4mol/L之間槲皮素的氧化峰電流與濃度呈線性關(guān)系， 線性回歸方程為：ipa1=88.977+34.203 c，r2=0.998 0。 檢測下限為 1.5×10-8mol/L，可用于槲皮素的微量檢測。

2.6 其它共存物質(zhì)的干擾實(shí)驗(yàn)

在最佳體系中研究了一些常見的金屬離子和有機(jī)物對槲皮素測定的干擾，結(jié)果表明，在l×10-2mol/L 的 Zn2+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Na+、Mg2+存在時，其峰電流基本上無變化，因此可以忽略對槲皮素測定的干擾。這可能是由于在陽極施加電壓時，上述金屬離子不會發(fā)生氧化還原反應(yīng)的原因。在100倍的葡萄糖、蔗糖，10倍的維生素C中，槲皮素的主峰電流只改變了1.99%、1.32%、－1.15%。當(dāng)10倍的抗壞血酸和尿酸存在時，槲皮素的氧化峰幾乎保持不變；但是當(dāng)1 000倍的抗壞血酸和尿酸存在時，卻能讓槲皮素的氧化峰消失，這是可能由于抗壞血酸、尿酸在電極上發(fā)生了氧化還原作用或吸附作用。在l×10-4mol/L的十二烷基苯磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨和Trinton-X100等對槲皮素的測定產(chǎn)生嚴(yán)重干擾（誤差＞5%）。當(dāng)其它黃酮類（如蘆?。┐嬖跁r，因?yàn)樗难趸迮c槲皮素的有部分重疊，所以它嚴(yán)重影響到槲皮素的測定，因此，當(dāng)它們共存時，在測定前要先進(jìn)行分離。

圖4 槲皮素各富集時間的循環(huán)伏安曲線圖Fig.4 CV curves of 0.01mmol/L Qu at CNTs/C with different enrichment time.The scan rate is 100 mV/s.Enrichment time is respectively(arrow direction):30,60,90,120,180,240,300,360,600,900,1 800,3 600 s

圖5 不同濃度下的槲皮素的循環(huán)伏安圖Fig.5 CV curves of Qu at CNTs/C in different concentrations.The scan rate is 100 mV/s.The B-R pH(1.81).c(Qu)(from inner to outer):1.0×10-6,5.0×10-6,1.0×10-5,5.0×10-5,1.0×10-4mol/L

2.7 電極的再生和重現(xiàn)性

每測定槲皮素后，對CNTs/C電極進(jìn)行表面再生，以消除電極的表面記憶，方法如下：將電極于 0.1mol/L KOH 溶液中，在-0.3～0.8 V 間循環(huán)掃描2～3圈，用二次蒸餾水洗凈，再將CNTs/C電極置于 pH=1.81 的 B-R 緩沖液中， 在-0.3～0.8 V間循環(huán)掃描2～3圈，使修飾電極得以活化，用于下一次測定。例如，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對1.0×10-5mol/L的槲皮素采用循環(huán)伏安法測定10次，每次測定后再生，峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.9%。

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，運(yùn)用循環(huán)伏安法對1.0×10-5mol/L槲皮素進(jìn)行測定，一天中每隔3 h測一次，峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 2.3%（n=5），峰電位則基本穩(wěn)定。將電極從溶液中取出，再生活化后，用二次蒸餾水洗滌，在干燥器中放置10 d，然后重新活化進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，RSD為2.6%。表明CNTs/C電極有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.8 蘆丁水解樣品分析及回收實(shí)驗(yàn)

稱取0.001 3 g蘆丁于小燒杯中，用20mL無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加入15mL 6%的HCl，超聲2 h后，冷卻至室溫，再加入無水乙醇定容。

分別移取1.0mL蘆丁水解產(chǎn)物，加入含有20.0mL的B-R緩沖液的電解池中，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定（n=4），將氧化峰電流的平均值ipa=5.043×10-4A帶入線性回歸方程，得到蘆丁的水解產(chǎn)物槲皮素的濃度為1.07×10-5mol/L。用標(biāo)準(zhǔn)加入法，加入一定量的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液（濃度為1.0×10-2mol/L）100 μL，150μL，計(jì)算添加回收率。結(jié)果見表1。

表1 蘆丁水解產(chǎn)物中槲皮素的測定（n=4）Tab.1 DeterminationofhydrolyzaterutinofQu

3 結(jié)論

該電極由于碳納米管是直接生長在石墨基體上的，無需粘結(jié)劑，比間接法制備的CNTs/C電極上滴涂的碳納米管粉末要穩(wěn)定得多，而且價(jià)廉、可批量生產(chǎn)，能多次反復(fù)用于槲皮素的檢測研究。測定過程操作簡單，方法靈敏準(zhǔn)確。

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