功能核酸檢測金屬離子研究進展

徐 慧， 高淑麗， 王麗華

（1.魯東大學化學與材料科學學院，山東煙臺264025)

(2.中國科學院上海應(yīng)用物理研究所，上海201800）

0 引言

金屬離子在生命科學、環(huán)境科學、醫(yī)學等領(lǐng)域扮演著重要角色，金屬離子的種類、濃度以及價態(tài)等性質(zhì)直接決定了它們的功能以及對環(huán)境和生物體的作用，因此對金屬離子進行特異性和高靈敏度檢測具有重要意義[1～2]。例如重金屬對人類健康的危害已是眾所周知，近年來重金屬對環(huán)境造成的污染已引起各國政府和人們的高度重視。一些過渡金屬等微量元素（如硒、鋅、鐵等）對人類以及其它生物的健康具有重要意義，它們是保持酶活性的重要參與物質(zhì)。維持生物體電解質(zhì)平衡的鉀鹽、鈉鹽等，同時也具有非常重要的生理功能。例如K+可參與諸如神經(jīng)脈沖傳遞和細胞活動調(diào)節(jié)等生物過程，在血液和尿液中的存在水平反映了身體的健康狀況，對臨床診斷非常重要[3]。因此對金屬元素的定性、定量檢測對生命、環(huán)境和醫(yī)學科學等都有重要意義。目前金屬元素的檢測主要采用光譜法，包括原子（吸收、發(fā)射、熒光等）光譜、分光光度法等，電化學、聲學等方法也有應(yīng)用[4～10]。但這些方法依賴于大型儀器和專人操作，在現(xiàn)場和野外檢測中受到限制。以冠醚類、多胺類、杯芳烴類等有機小分子為代表的化學傳感方法也有一定的發(fā)展，目前存在靈敏度低、可重復(fù)性差、檢測在有機溶劑中進行等不足之處，檢測的可靠性和實用性不高。因此迫切需要發(fā)展無污染的、簡便快速、高靈敏度和高特異性的方法來滿足微量金屬檢測的需要。

伴隨著分子生物學的快速發(fā)展，核酸適配體（aptamer）、 脫 氧 核 酶 （DNAzyme） 以 及 aptazyme（aptamer與DNAzyme的復(fù)合物）等一類具有特定生物功能的核酸分子被發(fā)現(xiàn)和合成。這類功能核酸的出現(xiàn)為生物傳感分析提供了更廣闊的發(fā)展空間，并已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷[11～12]、成像[13]、藥物篩選[14]、分離[15]、材料科學[16]、納米科學[17]、有機合成[18]和傳感檢測[19～22]等領(lǐng)域。 Aptamer是一類通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）技術(shù)體外篩選出來的對靶分子（target）具有高度親和力的一類DNA或RNA分子[23]。理論上，對于特定的目標分子，總能找到一種或多種與之特異性結(jié)合的aptamer，因此大大拓寬了應(yīng)用領(lǐng)域，被認為是生物傳感器最理想的識別元件之一[24～25]。DNAzyme是經(jīng)過SELEX篩選出來的一種具有催化功能的單鏈DNA片段[26]，具有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力。大多數(shù)的DNAzyme具有金屬離子依賴性，只有在特定金屬離子存在時才表現(xiàn)出催化活性。Aptazyme由兩個獨立的功能域組成，即能結(jié)合配體的aptamer和具有自剪切作用的DNAzyme，它充分綜合了aptamer的高親和力和DNAzyme的核苷酸序列專一性酶切活性等優(yōu)勢。這些功能核酸的出現(xiàn)為金屬離子檢測提供了更多的識別模式，例如金屬離子可以和aptamer進行特異性結(jié)合，并引起aptamer自身的構(gòu)象變化，通過監(jiān)測這種構(gòu)象變化來對金屬離子進行定性和定量分析。DNAzyme在特定金屬離子存在的條件下，可以導致DNA片斷在特定位置上發(fā)生酶解，生成更小的寡核苷酸片斷。由于DNAzyme的活性與金屬離子的濃度呈正相關(guān)，因此可以通過檢測DNAzyme的酶解產(chǎn)物來對金屬離子進行檢測。由于功能核酸與靶物質(zhì)具有高的親和力和高的特異性，所以具有靈敏度高、選擇性好等特點。目前基于功能核酸的生物傳感器主要是通過檢測產(chǎn)物的光學和電學性質(zhì)變化來實現(xiàn)的，具體包括熒光、比色以及電化學等方法。該文總結(jié)了近幾年來用于金屬離子檢測的功能核酸傳感器的研究工作進展,包括熒光傳感器、比色傳感器和電化學傳感器等內(nèi)容。

1 熒光傳感器

1.1 以熒光探針為信號轉(zhuǎn)換體

熒光分析法是生物傳感器中應(yīng)用最為廣泛的方法之一，具有靈敏度高，選擇性好，動態(tài)線性范圍寬，方法簡便，重現(xiàn)性好等優(yōu)點。例如在分子生物學中廣泛應(yīng)用的分子信標，利用了DNA構(gòu)象變化的原理，當雙標記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA在遇到互補DNA后，莖環(huán)打開導致熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）不能發(fā)生，熒光信號升高。該節(jié)介紹了基于aptamer的熒光生物傳感策略，主要是利用aptamer在結(jié)合靶分子后自身構(gòu)象發(fā)生變化，導致熒光信號升高或降低。

目前應(yīng)用最為廣泛的是雙熒光基團修飾型探針，即在aptamer的5'端和3'端分別標記上熒光基團（F）和猝滅基團（Q），類似于分子信標。Aptamer在結(jié)合target后，由柔性的單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成剛性的二級結(jié)構(gòu)，改變了FRET發(fā)生的效率并導致熒光信號的改變。Ueyama等[27]利用此原理檢測鉀離子，在PSO（potassium specific oligonucleotide，GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG）的5'端和3'端分別標記上熒光基團FAM（donor）和 TAMRA（acceptor）（圖1），當沒有 K+時，PSO為柔性單鏈，F(xiàn)AM和TAMRA離得較遠，不能發(fā)生有效FRET；而當有K+存在時，PSO可以特異性的形成G-四面體結(jié)構(gòu)，拉近了熒光基團和猝滅基團之間的距離，可以發(fā)生有效FRET，F(xiàn)AM在522 nm處的熒光強度明顯降低，TAMRA在582 nm處的熒光顯著升高。當用302 nm的紫外光照射時，熒光的顏色從黃色變?yōu)榧t色，實現(xiàn)了對K+的可視化檢測，而且過量Na+的存在不會干擾K+的檢測。

圖1 基于熒光標記檢測K+[27]Fig.1 Detection of K+with dual-labeled PSO[27]

利用上述原理以及Hg2+可以與胸腺嘧啶（Thymidine,T）發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，Ono等[28]設(shè)計了雙標記的富T序列作為探針實現(xiàn)了對汞離子的特異性檢測，檢測限為40 nmol/L。Liu等[29]利用 thrombin binding aptamer（TBA）作為探針來檢測Pb2+和Hg2+兩種離子。當存在Pb2+和Hg2+時，TBA會分別轉(zhuǎn)變?yōu)镚-四面體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光素與猝滅劑之間發(fā)生FRET，低至300 pmol/L的Pb2+和5.0 nmol/L的Hg2+即可以產(chǎn)生可測的熒光信號變化。這種基于aptamer的熒光標記的方法具有靈敏度高、特異性好的特點，但需對功能核酸進行雙熒光標記，成本較高。

聯(lián)吡啶釕、溴化乙錠（EB）、Sybr Green I（SG）等染料分子可以嵌入不同的DNA結(jié)構(gòu)中并表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)。在水溶液中，這些染料分子的熒光信號很低，一旦嵌入到DNA或RNA雙鏈區(qū)的非水“口袋”環(huán)境后，熒光信號大大增強。例如SG與單鏈DNA通過靜電相互作用結(jié)合，而與雙鏈DNA通過靜電結(jié)合和小溝結(jié)合兩種方式，兩種不同結(jié)合方式下SG熒光信號的強度相差10倍以上[30]。Aptamer的構(gòu)象變化導致與染料分子的結(jié)合力發(fā)生變化，并表現(xiàn)出熒光信號的升高或者降低，這主要是由于aptamer在結(jié)合target后會通過部分堿基配對而形成一定的三維結(jié)構(gòu)，這些局部配對堿基為染料分子的嵌入提供了可能。目前這種方法已用于IgE、血小板衍生生長因子（PDGF）、凝血酶及相思子毒素等蛋白質(zhì)大分子[31～33]及金屬離子的特異性檢測，它的最大優(yōu)勢在于不用對DNA或者目標分子進行共價標記。

Liu 等[34]以 MSO（mercury specified oligonucleotide,MSO）和SG為探針檢測Hg2+。MSO與Hg2+結(jié)合后由單鏈變?yōu)榘l(fā)卡結(jié)構(gòu)，SG能夠有效地區(qū)分這種結(jié)構(gòu)差異并表現(xiàn)出熒光增強。此方法無需對MSO進行標記，簡便快速，成本低廉，5 min內(nèi)即可實現(xiàn)低至1.33 nmol/L Hg2+的檢測。Chiang等利用T33序列和ToTo-3可以檢測到0.6 ppb（3 nmol/L）的Hg2+[35]。Liu等[36]進一步將檢測限降低到 0.5 nmol/L（0.1 ppb）主要原理是當 poly T 遇到Hg2+時能形成T-Hg2+-T復(fù)合物，影響了poly T與poly A雜交，雙鏈不能有效形成，導致SG的熒光強度降低。與傳統(tǒng)的熒光雙標記DNA檢測Hg2+的方法相比，該方法將靈敏度提高了2個數(shù)量級[28]。

利用胞嘧啶（Cytosine,C）與Ag+的特異性作用以及SG區(qū)分不同構(gòu)象DNA的原理，F(xiàn)an課題組對Ag+進行了檢測[37]，與檢測Hg2+的原理類似，富C序列在結(jié)合Ag+后由單鏈變?yōu)榘l(fā)卡結(jié)構(gòu)，SG與后者的作用較強，導致熒光顯著升高。利用該方法最低可以檢測5 nmol/L的Ag+，且整個過程在5 min內(nèi)即可完成。類似的，Xu等對K+進行了檢測，實驗證明，SG也可以插入G-四面體結(jié)構(gòu)中，導致熒光信號升高。Kong等[38]發(fā)現(xiàn)結(jié)晶紫Crystal violet（CV）能夠?qū)-四面體與單雙鏈DNA進行區(qū)分，并且發(fā)現(xiàn)CV具有識別平行和反平行G-四面體的能力[39]，當CV插入到反平行G-四面體后，可使熒光強度有很大程度的增強。由于富G序列與K+或Na+作用時會分別形成平行和反平行構(gòu)象，因此CV可以用來檢測K+。

與熒光標記方法相比較，利用染料分子的核酸嵌入式熒光探針檢測金屬離子的方法無需熒光標記，成本較低，簡單快速，而且靈敏度更好。

1.2 導電共聚物作為光學信號傳導體

導電共聚物具有獨特的光電性質(zhì)，例如強的吸光性能[40]（摩爾消光系數(shù)高達106L/(mol·cm)[41]）以及“分子導線”性質(zhì)等[41～42]，可以用作生物傳感器的信號傳導元件，Swager等[41～43]首先將其應(yīng)用于傳感領(lǐng)域。目前基于共軛聚合物的檢測方法能對納摩爾甚至皮摩爾級的金屬離子進行快速檢測[44～46]。Fan課題組利用聚芴的熒光性質(zhì)對DNA等進行了檢測[46～47]，并對各種基于不同傳感策略的共軛高分子光學生物傳感器研究進行了綜述[45～46]。導電高分子聚芴具有非常高的熒光量子產(chǎn)率,并且可以高效采集能量通過FRET傳遞給熒光素，從而顯著提高熒光素的熒光強度。Wang等[48]利用FAM標記的富G序列和聚芴，通過聚合物和FAM之間FRET效率的變化來檢測K+（圖2）。聚芴與單鏈的靜電力很弱，因此DNA遠離聚芴分子，與FAM的FRET很弱導致熒光很低。當加入K+后，DNA形成G-四面體構(gòu)型，增加了DNA表面的電荷密度，與聚芴之間的靜電作用變強，距離變近，它們之間可發(fā)生較強的FRET。為進一步提高FRET效率，他們利用EB作為過渡形成聚芴-FAM-EB的體系，實現(xiàn)了對富G序列由G-四面體到雙鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變的實時檢測[49]，并進一步提高了靈敏度。Xu等[50]利用導電高分子（PFP），對 YOYO-1（TOTO-1）檢測 Hg2+的方法做進一步放大，檢測限可達0.27 nmol/L。

圖2 利用共軛高分子實現(xiàn)對K+的檢測[48]Fig.2 Detection of K+based on conjugated polymer[48]

2 比色傳感器

2.1 基于金納米粒子的比色傳感器

納米金顆粒具有優(yōu)異的光學性質(zhì)、電學性質(zhì)、化學活性和生物兼容性，因此在生物領(lǐng)域尤其是生物傳感領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[51～52]。研究表明，納米金粒子的光學性質(zhì)與顆粒之間的距離密切相關(guān)，當顆粒的間距超過其平均直徑時，納米金呈分散狀態(tài)，宏觀上表現(xiàn)為紅色；當間距小于平均直徑時，呈聚集態(tài)，呈現(xiàn)紫色或藍色。這種顏色差異主要是因為聚集或分散態(tài)的納米金具有不同的表面共振頻率造成的[51]。納米金具有很好的生物相容性、化學反應(yīng)活性以及大的比表面積，可同時負載多條功能核酸序列，通過多價效應(yīng)增強與靶分子間的親和力和特異性。目前納米金探針已用于多種物質(zhì)的分析檢測。主要原理是基于靶分子可以誘導功能核酸空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并藉此引起金納米粒子之間的聚集-分散狀態(tài)改變，呈現(xiàn)不同的顏色，實現(xiàn)對靶分子的快速比色檢測[53～54]。

2.1.1 非修飾型納米金

Li等[55]發(fā)現(xiàn)納米金與DNA單鏈和雙鏈的作用明顯不同，單鏈DNA具有很好的柔性，堿基游離在外使得N原子有機會與納米金發(fā)生相互作用，通過Au-N鍵吸附在納米金表面，增加了納米金的表面電荷密度，大大提高了其耐鹽性。而雙鏈DNA的表面負電荷堆積程度高，并且dsDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)使N、S等原子包埋更深，因此ds-DNA與納米金有較強的排斥，不能吸附到納米金表面。當提高溶液中的鹽濃度時，納米金發(fā)生聚集，呈現(xiàn)藍色。利用這個性質(zhì)可以實現(xiàn)對單鏈和雙鏈DNA的區(qū)分，并實現(xiàn)對DNA的檢測。該方法不需要對顆粒、探針或靶序列進行共價修飾，操作簡便快速，整個檢測過程可以在10 min以內(nèi)完成。

利用納米金的這種性質(zhì)，F(xiàn)an課題組進一步研究了其它幾種不同DNA結(jié)構(gòu)與納米金的相互作用，并發(fā)展了一系列傳感策略用于K+[56]、Hg2+[57]、pH[57]等的快速檢測。在檢測K+的傳感策略中 （圖3），當溶液中沒有K+時，柔性的單鏈PSO吸附在納米金表面，有效的保護納米金免受高濃度鹽溶液引起的聚集。而存在K+時，柔性的PSO構(gòu)象轉(zhuǎn)化成剛性的G-四面體結(jié)構(gòu)，不能吸附在納米金表面，在高濃度鹽溶液中發(fā)生聚集，顏色由紅色變?yōu)樗{色。利用這種性質(zhì)實現(xiàn)了對K+的可視化檢測。類似的，利用MSO和Hg2+的特異性結(jié)合，該法實現(xiàn)了對Hg2+的高靈敏度和高選擇性可視化檢測[57～58]。Dong等利用富C序列（SSO）與Ag+特異性結(jié)合形成C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的性質(zhì)[59]，實現(xiàn)對Ag+的高靈敏度和高選擇性可視化檢測[60]，肉眼最低可觀察到52 nmol/L Ag+引起的納米金顏色變化。

圖3 利用納米金與不同構(gòu)象DNA之間作用的差異實現(xiàn)對 K+[56]和 Hg2+[57～58]的比色檢測Fig.3 Colorimetric detection of K+[56]and Hg2+[57～58]based on the different interaction of AuNPs and DNA

進一步結(jié)合納米金猝滅熒光的性質(zhì)，Wang等[61]可以檢測40 nmol/L的Hg2+，并且不受其它高濃度金屬離子的干擾。圖4中顯示，游離的熒光標記DNA探針被吸附在納米金表面并發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象。而Hg2+誘導單鏈DNA形成準雙鏈結(jié)構(gòu)，不在納米金表面吸附，熒光信號得以保持。該方法不需要對金納米粒子作任何共價修飾，檢測成本低，操作簡便快速；在水溶液中對Hg2+具有較高的靈敏度和特異性。

圖4 一種基于金納米離子與單雙鏈作用差異的熒光檢測汞離子策略[61]Fig.4 A novel fluorescent assay for Hg2+based on the different interactions of AuNPs and ssDNA/dsDNA[61]

2.1.2 修飾型納米金

納米金顆粒除了可與氨基發(fā)生非共價的靜電吸附外，還可與疏基形成Au-S共價鍵，這使得膠體金可與生物活性分子結(jié)合制備AuNP探針并用于生物體系的檢測。例如Mirkin研究組[62]將巰基DNA組裝在納米金表面得到AuNP-DNA復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，通過DNA雜交來改變納米金的分散-聚集狀況，構(gòu)建了基于納米金比色方法的檢測平臺。目前AuNP-DNA探針已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，有機小分子和金屬離子等的分析檢測[63～68]。Lee等利用兩段帶有T錯配的互補DNA分別修飾納米金，利用T-Hg2+-T配對導致的Tm值升高來實現(xiàn)對納米金距離的調(diào)控，使之在不同濃度Hg2+條件下呈現(xiàn)不同的顏色變化。該法可以特異性的檢測低至100 nmol/L的Hg2+[69]，但需要對檢測溫度進行控制。

Fan課題組[70]提出一種室溫下檢測水溶液中Hg2+的方法。利用AuNP-Tn探針與Hg2+結(jié)合形成準雙鏈的性質(zhì)，拉近納米金顆粒之間的距離，并呈現(xiàn)由紅色到藍色的變化。該法可檢測到5.0×10-6mol/L 的 Hg2+，且具有檢測快速、方便的優(yōu)點。Xue等[71]也發(fā)展了一種新穎、實際在室溫下檢測Hg2+的比色檢測手段（圖5）。他們設(shè)計了兩個修飾有DNA的金納米粒子 （記為探針A和B），同時引入了和兩個探針序列部分互補且含T-T錯配的探針C，只有Hg2+存在時，探針C可以特異性的識別探針A和B使其形成穩(wěn)定的雙鏈DNA，從而拉近了不同納米金探針的距離，使金納米離子發(fā)生團聚，顏色表現(xiàn)為藍色。重要的是通過控制三個探針T-T錯配的數(shù)量，可以在一定范圍精確調(diào)控三個探針的熔化溫度。

圖5 室溫下特異性檢測Hg2+原理示意圖：探針A和B部分序列和探針C互補，當存在Hg2+時，這三條DNA發(fā)生雜交，使納米金發(fā)生聚集，表現(xiàn)為藍色[71]Fig.5 The principle of specific detection of Hg2+at room temperature:probe C recognizes the particle probes A and B and forms stable DNA duplexes(or NP aggregated networks)only in the presence of Hg2+[71]

圖6 （A）Cu2+依賴性具有DNA連接活性的DNA酶的二級結(jié)構(gòu)。底物S1的3＇端用咪唑活化;（B）存在Cu2+時，E47DNA酶將S1、S2連接起來，導致納米金探針距離拉近發(fā)生團聚，顏色變?yōu)樗{色[77]Fig.6 (A)Secondary structure of Cu2+-dependent DNA ligation DNAzyme.The 3'end of substrate S1 was activated with imidazole;(B)In the presence of Cu2+,DNA enzyme E47 will connect S1 and S2 together,resulted in the formation of Au nanoparticles aggregate,reflected by the blue color[77]

結(jié)合DNAzyme的催化活性依賴于金屬離子的性質(zhì)，Li、Lu 等研究組[72～77]建立了基于納米金光學性質(zhì)變化的金屬離子檢測方法。通常DNAzyme的催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力只有在特定金屬離子的存在下才可以發(fā)揮作用，因此可以用來設(shè)計高特異性的金屬離子傳感器。Li等[72]利用Ag+介導的DNAzyme發(fā)展一種檢測Ag+的方法；Lu等利用DNA enzyme以及納米金聚集顏色變化效應(yīng)，發(fā)展了一系列特異性檢測Cu2+、Pb2+等金屬離子的方法[73～77]。圖6[77]描述了利用對Cu2+依賴性的DNAzyme連接酶，以及底物DNA修飾的納米金探針對Cu2+進行特異性檢測的策略，比色結(jié)果顯示出很好的特異性和高的靈敏度。

利用Pb2+依賴性的DNAzyme切割酶以及納米金與單雙鏈DNA作用的差異，可以檢測Pb2+[73]。首先制備了AuNP-DNA探針并通過與DNAzyme底物的雜交形成納米金聚集體（藍色），沒有Pb2+時，DNAzyme不能切割底物DNA，溶液保持藍色；而有Pb2+存在時，DNAzyme對底物DNA特定位點進行切割，底物DNA斷開，納米金聚集體重新分散在溶液中，呈紅色。利用這種方法可以檢測到10-7mol/L的Pb2+。

應(yīng)用納米金和功能核酸對金屬離子進行可視化檢測是一種簡便、快速、成本低廉、同時兼具較好靈敏度和高選擇性的方法，適合于野外檢測和現(xiàn)場監(jiān)測，因此有較好的應(yīng)用潛力。

2.2 基于導電高聚物的比色傳感器

聚噻吩（PT）是一類具有構(gòu)象效應(yīng)的共軛導電高分子，它的光學性質(zhì)伴隨著分子構(gòu)象的變化而變化。聚噻吩的共軛骨架上帶有正電荷，在外界環(huán)境影響下（如溫度、相反電荷底物等），骨架的平面結(jié)構(gòu)發(fā)生形變，并導致光學性質(zhì)（例如：顏色、紫外可見吸收光譜以及熒光光譜等）發(fā)生明顯變化。

Leclerc研究組結(jié)合aptamer的生物識別特性以及共軛導電高分子的光學性質(zhì)，發(fā)展了一系列基于聚噻吩構(gòu)象變化的DNA傳感器[78～82]。利用陽離子聚噻吩的構(gòu)象變化以及aptamer與K+之間的特異性作用，實現(xiàn)了對溶液相中K+的特異性比色檢測[80]。溶液中的聚噻吩分子共軛程度較低，主要以柔性的自由卷曲狀態(tài)存在，顏色呈黃色。當加入單鏈DNA時，PT與之結(jié)合并使自身的共軛程度增加，最大吸收峰發(fā)生紅移，溶液呈紅色。K+使ssDNA形成G-四面體結(jié)構(gòu)，與PT結(jié)合后導致PT的共軛程度較差，溶液呈黃色。通過觀察溶液顏色或紫外吸收的變化就可直觀簡單的檢測K+。

Tang等[83]將胸腺嘧啶T結(jié)合到聚噻吩的側(cè)鏈制備了可以用于Hg2+檢測的PTT探針。側(cè)鏈的T結(jié)合Hg2+后，聚噻吩主鏈的構(gòu)象由自由卷曲狀態(tài)變?yōu)閯傂缘木奂w構(gòu)象，相鄰的聚噻吩鏈之間形成π堆積的聚集體，導致熒光自猝滅，藉此可以特異性的檢測Hg2+。該方法可以檢測30 μmol/L的 Hg2+，檢測模式為“turn-off”模式。

Fan課題組[84]利用MSO探針以及陽離子聚噻吩衍生物PMNT的構(gòu)象效應(yīng)，實現(xiàn)了重金屬離子Hg2+在水相中的快速、可視化檢測。該方法無需任何修飾，檢測模式為“turn-on”模式，靈敏度較高。利用MSO探針在結(jié)合Hg2+后構(gòu)象發(fā)生變化的特性，PMNT以不同方式結(jié)合MSO并形成具有不同光學性質(zhì)的復(fù)合物，通過比色和熒光來進行檢測。直接用肉眼目測，在幾分鐘內(nèi)可檢測到12.5 μmol/L 的 Hg2+，結(jié)合熒光檢測方法，檢測限可以進一步提高到42 nmol/L。

3 電化學傳感器

在大多數(shù)情況下，溶液中單鏈DNA或RNA的空間構(gòu)象是不確定的，當靶分子存在時，會發(fā)生適應(yīng)性的折疊，形成G-四面體等特殊的三維空間結(jié)構(gòu)，通過特異性作用與靶分子緊密結(jié)合。這種結(jié)合前后的結(jié)構(gòu)差異，可以通過電活性物質(zhì)與電極表面的距離改變來識別，從而引起電化學信號的改變達到檢測靶分子的目的[85～89]。目前用來對核酸適配體進行標記的電活性物質(zhì)主要有二茂鐵、亞甲基蘭等。

Radi等[90]報道了識別K+的singal on型的電化學傳感器。將二茂鐵標記的巰基DNA通過自組裝固定在金電極表面作為捕獲探針 （圖7），溶液中沒有K+時，柔性單鏈DNA的二茂鐵遠離電極表面，電流信號較小。當加入K+后，DNA與K+形成G-四面體，二茂鐵靠近電極表面，電流信號變大。該方法檢測鉀離子的線性范圍為0.1～10 mmol/L，檢出限為 0.015 mmol/L。Han 等[91]也利用類似的原理檢測 Hg2+，線性范圍為 0.1～2 μmol/L，檢出限為0.1 μmol/L。并且可以重復(fù)使用。

圖7 應(yīng)用電化學原理根據(jù)適體構(gòu)象變化檢測K+[90]Fig.7 An electrochemical aptasensor for selective detection of,K+based on the conformational change of aptamer[90]

電化學方法具有儀器簡單、成本較低、靈敏度和特異性較好等優(yōu)點，但需要對功能核酸進行電化學標記，因此仍有待于進一步發(fā)展。

4 總結(jié)和展望

該文對近些年來基于功能核酸的金屬離子檢測方面的研究工作做了綜述，并比較了各種方法的優(yōu)缺點（表1）。功能核酸具有很多的優(yōu)越性，如穩(wěn)定性好，成本低，易于合成和修飾等，所報道的檢測方法大多簡單、方便，靈敏度高、選擇性好，能夠在水溶液中進行檢測，因此具有良好的應(yīng)用前景。但是目前仍然存在著一些需要解決的問題。

（1）多數(shù)方法在體外展開，并且目前主要以純品作為研究體系，在實際樣品中的應(yīng)用較少。主要是部分方法存在著靈敏度不夠，容易受雜質(zhì)干擾等缺點，在臨床試驗中體液等的檢測、環(huán)境樣品的實時、原位監(jiān)測等方面仍然難以得到應(yīng)用。但隨著納米技術(shù)的發(fā)展，更多生物相容性好、低毒性的納米粒子的發(fā)現(xiàn)以及更多新方法的建立等將為金屬離子的原位檢測創(chuàng)造條件。

（2）目前針對特定金屬離子檢測的功能核酸的種類還較少，使得應(yīng)用范圍受到限制。因此篩選更多的高特異性功能核酸對于功能核酸在生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。目前SELEX過程主要在實驗室條件下通過多輪PCR和分離進行，耗時耗力且效率較低。因此急需發(fā)展更加快速簡便的方法來提高篩選的效率，例如結(jié)合高通量的芯片篩選模式，以及結(jié)合計算機分子模擬方法等，加快篩選進程，獲得更多種類的功能核酸。

（3）在已有的功能核酸中，Ag+、Hg2+等的檢測主要依賴于堿基與金屬離子的特異性作用，而對序列的依賴性較低，這也為更加靈活的設(shè)計傳感策略提供了方便。

綜上所述，利用功能核酸來檢測金屬離子已經(jīng)取得了很好的發(fā)展，這些檢測方法具有簡便快速、成本低廉、重復(fù)性好、靈敏度和選擇性較為理想，因此受到廣泛關(guān)注。但是在實際樣品的檢測中仍存在較多問題。希望在不久的將來，通過生物學家、化學家、物理學家等的共同努力，伴隨納米技術(shù)、計算機技術(shù)、微機電技術(shù)的快速發(fā)展，基于功能核酸的生物傳感器能夠進入實用階段，實現(xiàn)現(xiàn)場、原位、高通量檢測，并向微型化、多樣化和人工智能化方向發(fā)展，滿足臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的需要。

表1 基于功能核酸的金屬離子檢測方法對比表Tab.1 Comparision if metal ions analysis methods based on functional nucleic acids

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