二穗短柄草幼胚再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的初步研究

吳雪莉，劉金星，Klaus K Nielsen，楊志民＊，高彩霞，＊

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京210095；2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101；3.Research Division，DLF－TRIFOLIUM A／S，丹麥466060）

二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）是溫帶一年生禾本科早熟禾亞科短柄草屬植物。原產(chǎn)于非洲北部、歐洲南部和亞洲中部，包含約10個(gè)亞種［1］，它與大多數(shù)的禾草親緣關(guān)系很近，與小麥（Triticumaestivum）、大麥（Hordeumvulgare）、燕麥（Avenasativa）等糧食作物的親緣關(guān)系比水稻更近［2－4］。水稻作為禾草最基本的模式植物［5，6］，其生長周期長，對生長環(huán)境要求高，尤其是在高產(chǎn)基因?qū)嶒?yàn)方面要求更高，此外，它屬于稻亞科，與早熟禾亞科之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因而并不是理想的禾草模式植物。而二穗短柄草在很多方面與擬南芥（Arabidopsisthaliana）有共同特點(diǎn)，擁有模式植物必備的物理特性和生物學(xué)特性［7－15］：基因組小、染色體少、DNA重復(fù)序列少、植株較矮、生長周期短、自花授粉等。與小麥族植物一樣具有二倍體、四倍體和六倍體，且不需要嚴(yán)格的生長條件和栽培措施，可以作為一種新型的禾草模式植物。目前，人們已經(jīng)開始對二穗短柄草進(jìn)行多方面的研究，從而更全面地確認(rèn)它作為模式植物的必然性。

遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是模式植物作為有效工具的關(guān)鍵，開展關(guān)于二穗短柄草遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究具有重要意義。近幾年來，短柄草越來越引起國內(nèi)外分子生物學(xué)研究者的重視，對其植物學(xué)特性、細(xì)胞遺傳學(xué)特性、分子生物學(xué)特性、基因組學(xué)發(fā)掘、組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化性能等進(jìn)行了研究，但目前國內(nèi)尚未見有關(guān)二穗短柄草遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究報(bào)道。本試驗(yàn)以國際短柄草協(xié)會(huì)正在構(gòu)建遺傳連鎖圖的二穗短柄草BD21和BD21－3品系及植株健壯、生長迅速的BDR018品系的幼胚為材料，研究了幼胚大小對胚性愈傷組織誘導(dǎo)及再生的影響，并探討了愈傷組織年齡及浸染過程中的不同處理對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BDR018遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，對建立高效穩(wěn)定的二穗短柄草離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2008年5月選取國際短柄草協(xié)會(huì)正在構(gòu)建遺傳連鎖圖的二穗短柄草BD21和BD21－3品系及植株健壯、生長迅速的BDR018品系的幼胚為材料，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，取抽穗2周左右的幼嫩籽粒，用1.5%的次氯酸鈉消毒15～20 min，無菌水沖洗5～6次，于超凈工作臺(tái)內(nèi)剝?nèi)∮着?，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26～28℃、黑暗條件下誘導(dǎo)胚性愈傷組織，5 d左右拔除幼芽。愈傷組織每2周在相同培養(yǎng)基上繼代1次。

1.2 農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒

本研究采用根癌農(nóng)桿菌菌株AGL1，質(zhì)粒載體PDM805如圖1［內(nèi)含bar基因（膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因）和gus報(bào)告基因（β－葡萄糖醛酸糖苷酶基因）］由丹麥DLF公司提供。

圖1 質(zhì)粒p DM805結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Map of plasmid pDM805

1.3 幼胚離體培養(yǎng)基

MS基本培養(yǎng)基：MS大量元素＋MS微量元素＋MS鐵鹽＋MS有機(jī)成分＋MS維生素。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS2.5）：MS基本培養(yǎng)基＋2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）（2.5 mg／L）＋水解酪蛋白（0.5 mg／L）＋CuSO4（0.6 mg／L）＋蔗糖30 g／L＋結(jié)冷膠（Gelrite）3.75 g／L。

選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS2.5－5B－Cefo200）：MS基本培養(yǎng)基＋2，4－D（2.5 mg／L）＋水解酪蛋白（0.5 mg／L）＋Cu－SO4（0.6 mg／L）＋蔗糖30 g／L＋Gelrite 3.75 g／L＋雙丙氨磷（Bialaphos）（5 mg／L）＋頭孢噻肟（Cefotaxime）（400 mg／L）。

再生培養(yǎng)基（M1G）：MS基本培養(yǎng)基＋激動(dòng)素 Kinetin（0.2 mg／L）＋蔗糖30 g／L＋Gelrite 3.75 g／L。

選擇再生培養(yǎng)基（M1G－5B－Cefo200）：MS基本培養(yǎng)基＋Kinetin（0.2 mg／L）＋蔗糖30 g／L＋Gelrite 3.75 g／L＋Bialaphos（5 mg／L）＋Cefotaxime（400 mg／L）。

壯苗培養(yǎng)基：1／2 MS基本培養(yǎng)基＋蔗糖30 g／L＋Gelrite 3.75 g／L。上述所有培養(yǎng)基均調(diào)p H值至5.8，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.4 幼胚愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化

從－80℃冰箱中取出含有質(zhì)粒p DM805的農(nóng)桿菌AGL1［9］菌液200μL（保存于15%甘油中，農(nóng)桿菌與甘油1∶1混合），接種于20～25 m L含有50 mg／L利福平以及20 mg／L四環(huán)素的YEP（酵母菌）液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)12～18 h。當(dāng)培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0后，將培養(yǎng)物于4 300 r／min離心10 min，收集菌體。用 MS 2.5液體培養(yǎng)基［MS基本培養(yǎng)基＋2，4－D（2.5 mg／L）＋水解酪蛋白（0.5 mg／L）＋CuSO4（0.6 mg／L）＋蔗糖30 g／L，p H 值5.8］洗滌2次后重新懸浮，調(diào)至OD600值為0.6～1.0。

選擇顏色鮮黃，生長旺盛，結(jié)構(gòu)密實(shí)的BDR018胚性愈傷組織（顆粒大小為1～2 mm），于農(nóng)桿菌菌液中浸染15～20 min，吸去菌液，并用滅菌濾紙吸干愈傷組織表面的菌液，轉(zhuǎn)移到蓋有濾紙的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26～28℃，暗培養(yǎng)48～72 h后，將共培養(yǎng)的愈傷組織用含有頭孢霉素（Cefotaxime，200 mg／L）的無菌水漂洗2～3次，每次1 min左右，將愈傷組織上的水分吸干，置于空培養(yǎng)皿中12～24 h，MS2.5液體培養(yǎng)基漂洗1次后轉(zhuǎn)移到選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26～28℃，暗培養(yǎng)2～3周。

1.5 轉(zhuǎn)化體的篩選與抗性植株再生

轉(zhuǎn)化2～3周后，將愈傷組織繼代到新的選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)箱（25℃，16 h光照，8 h黑暗）培養(yǎng)。每2周繼代1次。2次繼代后，將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待抗性再生綠苗長至3～4 cm時(shí)，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基內(nèi)，待抗性再生苗具有較健壯的根后，轉(zhuǎn)入花盆中，于溫室內(nèi)種植。

1.6 GUS基因化學(xué)組織檢測

將抗性再生植株葉片浸于X－Gluc溶液［含乙二胺四乙酸（EDTA）10 mmol／L、磷酸緩沖液100 mmol／L、亞鐵氰化鉀0.5 mmol／L、高鐵氰化鉀0.5 mmol／L、20%（V／V）甲醇和0.1%X－Gluc（W／V）］中，37℃下保溫?cái)?shù)小時(shí)，96%乙醇脫色，觀察藍(lán)色反應(yīng)。

1.7 轉(zhuǎn)化植株的PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）鑒定

取抗性再生植株和未轉(zhuǎn)化植株葉片，用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［10］微量提取植物DNA。本試驗(yàn)擴(kuò)增bar基因片斷的引物為 MS126（5′－GGATCTACCATGAGCCCAGA－3′）和 MS127（5′－TGCCTCCAGGGACTTCAG－3′）。PCR所用Taq酶、d NTP等購于Ampliqon公司，引物由Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增外源目的基因的大小約為357 bp。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

成愈率（%）＝愈傷組織數(shù)／接種幼胚數(shù)×100%。再生率（%）＝再生綠苗數(shù)／愈傷組織數(shù)×100%。白化率（%）＝再生白化苗數(shù)／愈傷組織數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼胚大小對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

根據(jù)幼胚（胚軸方向）長度將其分成3類即：Ⅰ類：幼胚長度小于0.5 mm（圖2A）；Ⅱ類：幼胚長度介于0.5～1.0 mm之間 （圖2B）；Ⅲ類：幼胚長度大于1.0 mm（圖2C）。2周后，統(tǒng)計(jì)幼胚的成愈率（表1）。

Ⅰ類幼胚，透明，胚的形狀稍不明顯。誘導(dǎo)過程中，出芽率極低，生長速度慢，胚性愈傷組織顏色鮮黃，顆粒致密緊實(shí)。Ⅱ類幼胚，半透明，胚的形狀明顯，出芽率較低，胚性愈傷組織顏色鮮黃，顆粒致密緊實(shí)，生長速度快于Ⅰ類，少量愈傷組織略帶水浸狀。Ⅲ類幼胚，不透明，近乳黃色，與成熟胚相似，出芽率高，生長速度快，但水浸狀愈傷組織較多。

二穗短柄草3個(gè)品系 BD21，BDR21－3，BDR018的成愈率與幼胚大小有關(guān)（表1）。Ⅰ類幼胚成愈率最低，Ⅱ類幼胚成愈率最高，Ⅲ類幼胚成愈率介于Ⅰ類幼胚和Ⅱ類幼胚之間。相同幼胚大小，不同品系的幼胚成愈率也不同。Ⅰ類幼胚中BDR018的成愈率最低，僅13.8%。Ⅱ類幼胚中BD21的成愈率最高，達(dá)87.8%，BDR21－3和BDR018的成愈率分別為85.6%和72.9%。Ⅲ類幼胚中BD21的成愈率最高，各品系成愈率均在50%左右。由此可見，長度介于0.5～1.0 mm之間的Ⅱ類幼胚，成愈率最高且愈傷組織顆粒致密，結(jié)構(gòu)緊實(shí)，顏色鮮黃，生長速度較快，適合用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化受體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

圖2 幼胚大小和愈傷組織Fig.2 Size of immature embryo and embryonic calluses of

表1 幼胚大小對二穗短柄草幼胚成愈率的影響Table 1 Effect of embryo size on frequency of calli initiation in three B.distachyon accessions

2.2 愈傷組織年齡對愈傷組織分化的影響

將誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織，按照不同年齡，接種在再生培養(yǎng)基上（M1G）于光照培養(yǎng)箱（25℃，16 h光照，8 h黑暗）進(jìn)行分化培養(yǎng)。3周后統(tǒng)計(jì)再生率和白化率（圖3）。

隨愈傷組織年齡的增加，BDR018，BD21，BD21－3愈傷組織的再生率下降，白化率上升。愈傷組織年齡為5周時(shí)再生率最高，分別為100%，100%和85.3%（圖3）。21周時(shí)再生率最低，分別為14.7%，30.3%和17.6%。5周時(shí)各品系的白化率最低。其中BDR018和BD21的白化苗和非再生愈傷組織從8周開始出現(xiàn)，而BD21－3從5周開始已有非再生現(xiàn)象產(chǎn)生。BDR018和BD21的胚性愈傷組織在5～8周范圍內(nèi)具有高的再生率和低的白化率，BDR018的再生率較其他2個(gè)品系最高。BDR018、BD21和BD21－3的再生率大于60%的愈傷組織，年齡分別為18，15，11周。綜合上述BDR018的胚性愈傷組織的成愈率及分化再生率均較高，且可作為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料的愈傷組織年齡范圍最寬。以下遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)均以BDR018胚性愈傷作為轉(zhuǎn)化受體。

圖3 愈傷年齡對愈傷組織分化的影響Fig.3 Effect of different age of callus on differentiation in three B.distachyon accessions

2.3 愈傷組織年齡對轉(zhuǎn)化的影響

以5，8，11，15，18，21周的BDR018胚性愈傷組織為受體材料，菌體由MS2.5液體培養(yǎng)基重新懸浮，菌液中加入0.01%的Silwet L－77，混合均勻，浸染愈傷組織15～20 min進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化率＝抗性再生植株數(shù)／愈傷組織數(shù)）。結(jié)果表明（表2），愈傷組織年齡為5～8周時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，平均轉(zhuǎn)化率為39.6%和37.4%。隨著愈傷組織年齡的增加，轉(zhuǎn)化率明顯降低。21周時(shí)轉(zhuǎn)化率最低僅2.8%。不同年齡愈傷組織的平均轉(zhuǎn)化率為21.4%。

2.4 真空處理和Silwet L－77處理對轉(zhuǎn)化的影響

以5周的BDR018愈傷組織為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，比較了不同處理對轉(zhuǎn)化率的影響。Ⅰ處理為對照，菌體在MS2.5液體培養(yǎng)基中重新懸浮后直接浸染愈傷組織；Ⅱ處理在菌體由MS2.5液體培養(yǎng)基重新懸浮后，在菌液中加入0.01%的Silwet L－77，混合均勻浸染愈傷組織。Ⅲ處理的菌液與Ⅰ對照處理相同，愈傷組織于空培養(yǎng)皿中，加入菌液浸染30 min，其間將培養(yǎng)皿放入基因槍真空室中進(jìn)行真空處理，真空室內(nèi)壓力保持50 m bar，處理時(shí)間為5 min。

結(jié)果表明（表3），真空處理和0.01%的Silwet L－77處理均可顯著提高轉(zhuǎn)化率。真空處理和0.01%Silwet L－77處理的平均轉(zhuǎn)化率分別為39.6%和41.0%，顯著高于對照的平均轉(zhuǎn)化率14.1%，真空處理和0.01%的Silwet L－77處理的轉(zhuǎn)化率相近。

2.5 GUS檢測結(jié)果

待抗性植株移至溫室后，取植株新鮮葉片進(jìn)行g(shù)us基因化學(xué)組織檢測，葉片GUS染色結(jié)果從無色到深藍(lán)色表現(xiàn)不一致（圖4），無色的葉片說明GUS基因未在植物中表達(dá)，淺藍(lán)色和深藍(lán)色葉片說明GUS基因已經(jīng)在植物中得到穩(wěn)定表達(dá)。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

隨機(jī)選取12株轉(zhuǎn)基因抗性植株和2株非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镞M(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明，除了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镆酝?，所有的轉(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增出了357 bp的bar基因DNA片斷（圖5），證明bar基因已整合進(jìn)二穗短柄草基因組中。

表2 愈傷組織年齡對轉(zhuǎn)化率的影響Table 2 Effect of different age of calli on the efficiency of transformation

表3 真空處理和0.01%Silwet L－77處理對轉(zhuǎn)化率的影響Table 3 Effect of vacuum infiltration or 0.01%Silwet L－77 on the efficiency of transformation

3 討論

高頻的離體再生系統(tǒng)及穩(wěn)定的外植體來源是轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)必備的條件，也是影響遺傳轉(zhuǎn)化效率提高的重要因素。在禾谷類轉(zhuǎn)基因研究中，雖然成熟胚取材和操作方便，生理狀態(tài)一致，是組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化理想的外植體，但幼胚再生能力較高，在成熟胚高頻率再生體系尚未建立的情況下，幼胚培養(yǎng)具有重要作用。研究表明幼胚大小介于0.5～1.0 mm之間時(shí)，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最高。大于1.0 mm的幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率均在50%左右，且出芽率較高，水浸狀愈傷組織較多，這可能是由于較大的幼胚接近于成熟胚，具有較高的分化程度，而脫分化和再生能力下降。這與Draper等［2］對幼胚大小的研究具有相似結(jié)論，取二穗短柄草二倍體基因型ABR1不同大小的未成熟胚分別接種在LS和N6附加2.5 mg／L 2，4－D培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，長度0.3～0.7 mm的未成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的潛力最大，在LS2.5培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為45%，胚性愈傷組織白苗分化率僅為7%，而在N62.5培養(yǎng)基產(chǎn)生的胚性愈傷組織白苗分化率高達(dá)45%。但Draper等［2］是以二穗短柄草二倍體基因型ABR1為材料，而相同幼胚大小，不同基因型的誘導(dǎo)率之間仍存在顯著差異。BD21誘導(dǎo)率最高達(dá)87.8%，BD21－3和BDR018誘導(dǎo)率分別為85.6%，72.9%。BD21和BDR018的誘導(dǎo)率均高于他人報(bào)道的68%和46%，而BD21－3的誘導(dǎo)率低于Philippe等［11］的研究結(jié)果94%，這可能與基因型對誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇有關(guān)［12］。

愈傷組織年齡對不同基因型的愈傷組織的分化再生具有顯著影響。研究表明，在5～8周內(nèi)胚性愈傷組織具有較高再生率，為轉(zhuǎn)化提供了良好的受體系統(tǒng)。這一結(jié)果與Christiansen等［13］對二倍體基因型和四倍體基因型幼胚培養(yǎng)的研究相同。BDR017、BDR030、BDR001和BDR018愈傷組織愈齡3～6周時(shí)的再生率為90%～100%，8周時(shí)的再生率低于80%，培養(yǎng)時(shí)間越長再生率越低，如BDR017、BDR030愈傷組織培養(yǎng)16周時(shí)的再生率分別為30%和55%。

圖4 GUS染色Fig.4 GUS staining

圖5 PCR檢測bar基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)Fig.5 Expression of bar in transgenic plants

農(nóng)桿菌介導(dǎo)二穗短柄草的遺傳轉(zhuǎn)化研究，主要集中于對BD21的轉(zhuǎn)化研究，而對BDR018的研究目前僅有少數(shù)，國內(nèi)尚未見關(guān)于BDR018遺傳轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道。Vogel和Leong等［14］利用幼胚和成熟胚來源的胚性愈傷組織及AGL1菌系和p OL001載體首次開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化短柄草的研究，14個(gè)基因型中有10個(gè)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率0.4%～15.0%。Christiansen等［13］用基因槍轉(zhuǎn)化法對BDR018幼胚的胚性愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化平均轉(zhuǎn)化率5.3%，Vain等［15］用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對BDR018幼胚愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，BDR018農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的效率高達(dá)55%，高于本實(shí)驗(yàn)中愈齡為5周的BDR018胚性愈傷組織的最高轉(zhuǎn)化效率40.3%和真空處理5 min的最高轉(zhuǎn)化效率43.1%。原因可能是由于實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化的愈傷組織年齡為5周高于前兩者作為受體材料的愈傷組織年齡，但是由于培養(yǎng)5周的愈傷組織可以獲得更多的轉(zhuǎn)化受體材料，因此雖然轉(zhuǎn)化效率稍低，但仍具有重要的意義。浸染過程中，真空處理5 min和菌液中加入0.01%的Silwet L－77，均可提高轉(zhuǎn)化效率。真空處理可提高轉(zhuǎn)化率可能是由于真空使浸染環(huán)境產(chǎn)生負(fù)壓，使菌液充滿微孔從而提高轉(zhuǎn)化效率。苜蓿（Medicagosativa）［16］、結(jié)縷草（Zoysiajaponica）［17］、花生（Arachishypogaea）［18］等的遺傳轉(zhuǎn)化中利用負(fù)壓處理，轉(zhuǎn)化效率也得到不同程度的提高。

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