丹參脂溶性成分提取方法研究

楊千才， 柳仁民

（聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東聊城 252059）

丹參為唇形科植物丹參Salviae miltiorrhizaeBge.的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效［1］，是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥材?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)丹參的化學(xué)成分主要分為脂溶性成分及水溶性成分兩大類，脂溶性成分主要為二萜類化合物，如隱丹參酮、丹參酮 IIA、丹參酮 I等［2，3］;水溶性成分主要為酚酸性化合物，如丹參素、原兒茶酸、丹酚酸B等［4，5］。丹參酮類化合物是丹參的脂溶性主要成分，在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物由于參與機(jī)體的多種生物化學(xué)反應(yīng)而表現(xiàn)出多種藥理作用，對(duì)心腦血管疾病、肝炎、白血病等具有潛在的治療作用［6，7］。

有關(guān)丹參酮的提取工藝文獻(xiàn)報(bào)道很多［8-10］，然而大都是以極性較大的乙醇作為提取溶劑，結(jié)果導(dǎo)致提取物中水溶性成分含量高，而丹參酮的相對(duì)含量較低，不利于后續(xù)對(duì)丹參酮的分離純化。本試驗(yàn)考慮使用極性較小的提取溶劑，不但對(duì)于丹參酮類脂溶性成分會(huì)有較好的提取效果，而且會(huì)大大降低提取物中水溶性成分的含量，這樣水溶性成分更多的留在了藥渣內(nèi)，也更有利于進(jìn)一步對(duì)藥渣中水溶性成分的提取，達(dá)到綜合提取丹參有效成分的目的。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司），包括G1311A四元泵，G1315B陣列二極管檢測(cè)器，Rheodyne7225i定量進(jìn)樣閥，G1322A在線真空脫氣機(jī)，Agilent HPLC化學(xué)工作站。

UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司），F(xiàn)Z102微型植物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司），AR-1104D電子天平（奧克斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司），SK3300LH超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦滬西儀器廠），HH-6數(shù)顯恒溫水浴器（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.2 試劑與藥材 乙酸乙酯、二氯甲烷為分析純（天津市化學(xué)試劑三廠），95%乙醇（山東廣源醫(yī)藥酒精有限公司），HPLC所用甲醇為色譜純（Tedia Company，USA），水為過(guò)濾的蒸餾水。

隱丹參酮與丹參酮IIA對(duì)照品為本實(shí)驗(yàn)室從丹參根中分離純化制得，經(jīng)HPLC測(cè)定純度均大于99%，結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR與13CNMR得以鑒定。

丹參藥材購(gòu)于聊城市中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為正品藥材。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱:Spherigel C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司）;流動(dòng)相:甲醇-水（75∶25，v/v）等度洗脫;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;溫度:室溫;進(jìn)樣量:20 μL。在此色譜條件下，丹參酮類成分可以獲得較好的分離，隱丹參酮、丹參酮IIA對(duì)照品溶液及丹參粗提物的色譜圖如圖1所示。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.2.1 供HPLC測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別準(zhǔn)確稱取隱丹參酮對(duì)照品4.0 mg，丹參酮IIA對(duì)照品5.6 mg，置50 mL量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為隱丹參酮80 μg/mL，丹參酮IIA112 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、7.0 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;分別精密吸取20 μL，依次進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:隱丹參酮:Y=40.933X+48.154，r=0.999 7;丹參酮 IIA:Y=24.533X+80.923，r=0.999 9。結(jié)果表明，隱丹參酮、丹參酮 IIA分別在 8～56 μg/mL、11.2～78.4 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 隱丹參酮（A）、丹參酮IIA（B）及丹參粗提物（C）的色譜圖

2.2.2 供總丹參酮測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取60℃減壓干燥至恒重的丹參酮IIA對(duì)照品1.2 mg，置10 mL量瓶中，用氯仿溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.112 mg/mL的丹參酮IIA對(duì)照品溶液。精密吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.7 mL，置于 10 mL量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，使?jié)舛确謩e為1.12、2.24、4.48、6.72、7.84 μg/mL，以氯仿為空白，于波長(zhǎng)271 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行一元線性回歸，得回歸方程為:A=0.086C+0.003，r=0.999 7，結(jié)果表明丹參酮IIA對(duì)照品在1.12～7.84 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 供HPLC測(cè)定用樣品溶液的制備 丹參藥材粉碎過(guò)30目篩，混合均勻。準(zhǔn)確稱取丹參粉末適量，加入一定量的溶劑，用不同的方法提取，提取液過(guò)濾，減壓濃縮至干，得到丹參酮粗提物。稱取適量粗提物，用甲醇溶解并定容至一定體積，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.3.2 供總丹參酮測(cè)定用樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取2.3.1項(xiàng)下方法制備的丹參酮粗提物適量，用氯仿溶解并定容至一定體積，得供試品溶液。

2.4 樣品含量測(cè)定

2.4.1 HPLC法測(cè)定樣品中丹參酮IIA和隱丹參酮的含量 精密量取2.3.1項(xiàng)下方法制備的樣品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

2.4.2 紫外分光光度法測(cè)定樣品中總丹參酮含量取2.3.2項(xiàng)下方法制備的樣品溶液于271 nm處測(cè)定溶液的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總丹參酮的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑與提取方法的選擇 使用超聲和回流兩種提取方法，以總丹參酮、隱丹參酮和丹參酮IIA為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用分光光度計(jì)和HPLC進(jìn)行分析測(cè)定，在提取時(shí)間、液固比相同的條件下比較了95%乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷三種極性各不相同的溶劑對(duì)丹參酮類成分的提取效果，結(jié)果列于表1中。

從表1可見(jiàn)提取溶劑對(duì)丹參酮的提取效果有很大的影響。當(dāng)使用極性較大的乙醇作為提取溶劑時(shí)，由于選擇性不高，盡管丹參酮的絕對(duì)量較高，但是由于極性大的丹酚酸類成分的溶出量也最高，因此導(dǎo)致提取液中丹參酮的相對(duì)含量降低。當(dāng)采用極性較小的乙酸乙酯或二氯甲烷作為提取溶劑時(shí)，由于此時(shí)水溶性成分溶出量降低，因此丹參酮的相對(duì)含量明顯提高。鑒于二氯甲烷的毒性較強(qiáng)，乙酸乙酯為最佳提取溶劑。另外提取方法對(duì)丹參酮的提取效果也有較大的影響，使用乙酸乙酯回流提取所得丹參酮的量多于超聲提取，這是由于丹參酮的溶解度隨溫度升高而增大。故而最終確定乙酸乙酯熱回流為丹參脂溶性成分的最優(yōu)提取方法。

表1 不同的提取溶劑和方法對(duì)丹參酮類成分的提取效果（n=3）

3.2 單因素試驗(yàn)及結(jié)果

3.2.1 液固比的選擇 乙酸乙酯為提取溶劑，回流提取時(shí)間為0.5 h，液固比（mL/g）分別為3∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10 ∶1、20 ∶1，室溫條件下考察液固比對(duì)丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結(jié)果（n=3）見(jiàn)圖2。

圖2 液固比對(duì)提取率影響

由圖2可知，隨液固比的增加，丹參藥材得到完全浸潤(rùn)，使得有效成分很好地溶出，當(dāng)液固比為8:1時(shí)，隱丹參酮和丹參酮IIA的提取率達(dá)最大值;此后，隨液固比的增加，提取率略有下降?？紤]到溶劑利用的經(jīng)濟(jì)效益，在合適的范圍內(nèi)選擇較小的液固比較合適。

3.2.2 提取時(shí)間的選擇 乙酸乙酯為提取溶劑，液固比為8 ∶1，回流提取時(shí)間分別為 0.5、1 h、1.5、2 h，室溫條件下考察提取時(shí)間對(duì)丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結(jié)果（n=3）見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，隱丹參酮收率變化不大，而丹參酮IIA在1.5 h之后收率有明顯下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)榈⑼狪IA不穩(wěn)定，在長(zhǎng)時(shí)間的提取過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)化分解［11］，故選擇較短的回流時(shí)間更為合適。

3.2.3 提取溫度的選擇 乙酸乙酯為提取溶劑，液固比為8∶1，回流提取時(shí)間為0.5 h，提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，室溫條件下考察溫度對(duì)丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結(jié)果（n=3）見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)提取率影響

由圖4可知，從60℃到70℃，隨溫度升高，丹參酮的提取率緩慢上升，70℃時(shí)達(dá)極大值，而超過(guò)70℃，卻有較明顯的下降，這是由于丹參酮類成分的穩(wěn)定性受濕熱影響很大，溫度過(guò)高，丹參酮發(fā)生分解所致［12，13］，所以加熱溫度控制在70℃比較合適。3.2.4 提取次數(shù)的選擇 乙酸乙酯為提取溶劑，液固比為8∶1，回流提取時(shí)間為0.5 h，提取溫度為70℃，分別提取1、2、3和4次，室溫條件下考察提取次數(shù)對(duì)丹參藥材中丹參酮提取率（mg/g）的影響，結(jié)果（n=3）見(jiàn)圖5。

圖5 提取次數(shù)對(duì)提取率影響

由圖5可知，提取兩次后，再增加提取次數(shù)，丹參酮的提取率無(wú)明顯增加，故提取次數(shù)控制在2次為宜。

4 結(jié)論

用乙醇作為提取溶劑，丹參中大量的水溶性成分也被提取出來(lái)，導(dǎo)致提取物中丹參酮的含量降低。而使用乙酸乙酯作為提取溶劑，由于水溶性成分溶出量較少，不僅有利于提高提取物中丹參酮的含量，而且有利于進(jìn)一步對(duì)藥渣中水溶性成分進(jìn)行提取，達(dá)到全面提取丹參有效成分的目的。

此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參酮遇熱不穩(wěn)定，因此提取溫度要控制在80℃以下，提取溶劑的濃縮回收也應(yīng)在低溫（60℃以下）減壓下操作。

本文通過(guò)研究不同提取溶劑、不同提取方法、提取時(shí)間、溫度、液固比和提取次數(shù)對(duì)丹參酮類成分提取效果的影響，確定了最佳的提取工藝條件為:乙酸乙酯為提取溶劑，按8∶1的液固比于70℃回流提取2次，每次0.5 h。

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