DNA甲基化生物學特征及其在胚胎、生殖細胞發(fā)育、衰老中的變化研究進展

孟燕,喬杰

(北京大學第三醫(yī)院 ，北京100083)

衰老是人類生活中自然而漸進的過程，主要表現(xiàn)為組織功能的逐漸減退，它受遺傳、環(huán)境、生活方式、疾病等多種因素的影響。機體衰老是細胞衰老的結(jié)果,而細胞衰老是DNA維持、修復、控制過程異常的結(jié)果。DNA甲基化是衰老過程中研究最深入的表觀遺傳修飾之一。近年來，隨DNA甲基化檢測技術特別是全基因組定量法的普及，DNA甲基化形成、DNA去甲基化以及DNA甲基化的作用機制等已逐漸明確。DNA甲基化與年齡的關系通常被歸類為“表觀遺傳漂變”現(xiàn)象，其特征是基因組的逐漸廣泛去甲基化和基因特異啟動子相關的CpG島(CGIs)的超甲基化[1]。表觀遺傳修飾是指基因堿基序列不發(fā)生改變，但基因表達發(fā)生了可遺傳性改變的調(diào)控方式[2]。表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控及染色體空間結(jié)構(gòu)調(diào)控等。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)、最重要的基因表觀修飾方式之一，動物組織DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點上。Cp甲基化是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNA methyltransferases，Dnmts)將甲基基團轉(zhuǎn)移到 DNA 胞嘧啶殘基上的過程[3]。DNA甲基化在調(diào)控基因表達、染色體結(jié)構(gòu)維持、X染色體失活和基因組印跡中起重要作用[4]?，F(xiàn)將DNA甲基化的生物學特征，及其在胚胎、生殖細胞發(fā)育和與衰老相關的模式的研究進展綜述如下。

1 DNA甲基化的生物學特征

1.1 DNMTs DNMTs是保守的催化序列，在DNA甲基化中起著關鍵性的作用。它催化甲基產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶，然后添加在DNA的CG二核苷酸的胞嘧啶上。哺乳動物組織中有四種DNMTs：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L。DNMT1 作用于僅有一條甲基化鏈的DNA雙鏈，催化甲基轉(zhuǎn)移到新合成的DNA鏈上, 使其完全甲基化，此現(xiàn)象稱為維持甲基化; 而 DNMT3A和DNMT3B則催化新的甲基化位點發(fā)生反應, 稱為從頭甲基化。通過DNMTs的催化, DNA 甲基化才得以完成。

Yin 等[5]研究發(fā)現(xiàn)， DNMT1 、 DNMT3A在人類絨毛和蛻膜組織中表達, 當胚胎中DNA維持甲基化受到抑制時, 胚胎著床率降低, 胎兒流產(chǎn)的風險增加。這說明胚胎的著床與發(fā)育異?？赡芘c胚胎中 DNA 維持甲基化缺陷有關。 晁遠等[6]研究結(jié)果顯示, DNMT1、DNMT3A mRNA在自然流產(chǎn)絨毛組織中的表達量明顯低于人工流產(chǎn)絨毛組, 且二組DNMT3B mRNA的表達量間差異無統(tǒng)計學意義,說明DNMT1、DNMT3A mRNA表達下調(diào)可能是造成絨毛中DNA甲基化不足的原因。DNMT1、DNMT3A 表達降低可能是自然流產(chǎn)的一種獨立誘發(fā)因素。

1.2 CpG島 DNA中的5-甲基胞嘧啶(5 mC)被稱之為人類DNA的第5種堿基，約占基因組堿基的1%。哺乳動物中CpG以兩種形式存在：一種分散于DNA序列中；另一種呈現(xiàn)高度聚集狀態(tài)，稱之為CpG島(CGIs)。CGIs指大于500個堿基對，且GC二核苷酸占50%以上DNA序列，60% CpG島位于基因啟動子區(qū)域， 其內(nèi)的CpG通常是非甲基化的，從而允許相關基因轉(zhuǎn)錄[7]。而大部分分散的CpG是甲基化的。相反，位于基因體的甲基化CpG二核苷酸不影響基因轉(zhuǎn)錄，但是可能會阻礙啟動子的激活[8]。余下40%的CGIs位于基因間和基因內(nèi)區(qū)域，因與啟動子無關而被定義為“孤兒CGIs”[9]。離啟動子CGIs至少2 kb處的CpGs密度較低(CGI約1/10)，被定義為CGI海岸，它們也參與基因表達的調(diào)控。CGI海岸經(jīng)常與組織特異性差異甲基化區(qū)域(DMRS)在正常組織中重疊[10]。

1.3 DNA去甲級化 DNA去甲基化包括主動去甲基化和被動去甲基化。

被動去甲基化是細胞通過抑制DNMT1表達來阻斷DNA甲基化維持，在細胞分裂過程中稀釋基因組中甲基化胞嘧啶的濃度，實現(xiàn)被動去甲基化。據(jù)報道[11]這種被動去甲基化機制是小鼠胚胎發(fā)育過程中原始生殖細胞去除基因組親本DNA甲基化的關鍵機制。[4]主動去甲基化是通過生物酶改變胞嘧啶上的甲基化修飾，可直接去除胞嘧啶上的甲基化，也可對甲基化進行修飾而導致胞嘧啶的改變。參與這一系列反應的是一組酶—TET蛋白。TET蛋白家族有三個成員，分別是TET1、TET2、TET3。TET蛋白可以將5 mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5 hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)等一系列修飾形式。而胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)觸發(fā)堿基修復(BER)過程，將5fC和5caC修復為未甲基化胞嘧啶。AID/APOBEC(活化誘導脫氨酶/載脂蛋白B編輯復合物)酶可能涉及5 mC和5 hmC脫氨過程中，將5 mC和5 hmC脫氨基形成胸腺嘧啶和5-羥甲基尿嘧啶(5hmU)，然后通過BER/TDG活性從DNA中除去[12]。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)，5 hmC不僅僅是去甲基化的中間產(chǎn)物，它可以作為穩(wěn)定的表觀遺傳信號，因此，和 5 mC類似， 5 hmC 被認為是DNA的額外堿基[13]。然而， 5 hmC 水平在不同類型的細胞和組織中差異很大，含量最高的為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)[14]。在大腦中， 5 hmC在轉(zhuǎn)錄起始位點和主動轉(zhuǎn)錄基因的基因體上富集。更特異的是， 5 hmC 位于基因外顯子-內(nèi)含子交界處。另外，5 hmC 也位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的側(cè)翼區(qū)域，如增強子/沉默子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。類似的模式發(fā)生在CGIs上，其中5 hmC位于它們的邊界。但是，在重復序列中(例如SINE、LINE、LTR和衛(wèi)星DNA)5 hmC的含量是低的[13]。5 hmC 作用機制尚不完全清楚，但是有研究顯示 5 hmC 的定位受DNA序列和染色體表觀遺傳蛋白因子的影響[15]，從而推測該表觀遺傳信號影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能是合理的。例如，大腦中5 hmC由是MeCP2識別和結(jié)合，與轉(zhuǎn)錄功能有關[16]。關于5fC和5caC，由于它們在哺乳動物基因組中及其稀少，從而限制了我們對它們功能的認識。但是，一些研究[17]表明，這些去甲基化中間產(chǎn)物在哺乳動物基因組中是穩(wěn)定的，這為我們進一步研究其去甲基化之外的功能創(chuàng)造了條件。

2 DNA甲基化在胚胎、生殖細胞發(fā)育及衰老中的變化

DNA甲基化的變化從受孕開始，發(fā)生在整個生命過程。人類早期胚胎發(fā)育過程中，經(jīng)歷兩次大規(guī)模的DNA甲基化重編程，即整體范圍的去甲基化和重新甲基化，分別發(fā)生在早期胚胎發(fā)育階段和配子形成階段。環(huán)境、生活方式、營養(yǎng)等會影響DNA甲基化的模式。大多數(shù)組織的平均DNA甲基化水平在生命早期增加，隨著年齡的增長而逐漸降低。

2.1 DNA甲基化在胚胎發(fā)育、生殖細胞發(fā)育過程中的變化 小鼠的早期胚胎發(fā)育過程中經(jīng)歷了整體范圍的去甲基化和重新甲基化過程．小鼠精子的平均甲基化水平約為 80%，卵細胞約為 50%，在受精后3.5 天左右的內(nèi)細胞團(ICM) 時期， 甲基化水平降至最低，約為20%。胚胎從ICM 發(fā)育到 7.5 天左右，發(fā)生了整體范圍的重新甲基化，平均甲基化水平達到 73%[18]。近期在人早期胚胎發(fā)育的研究[19]中發(fā)現(xiàn)，人類與小鼠及其他哺乳動物的早期胚胎 DNA 甲基化動態(tài)非常相似。大體遵循著生殖細胞高甲基化、胚胎低甲基化；合子中親本的甲基化信息被大規(guī)模消除并重建的過程。在早期胚胎大規(guī)模去甲基化的過程中，部分區(qū)域仍然維持了生殖細胞中的甲基化水平，這些區(qū)域主要是印跡調(diào)控區(qū)(imprinting control regions，ICR)。ICR 可以被劃分為生殖細胞印跡調(diào)控區(qū)(germ-lineICRs, gICRs)和體細胞印跡調(diào)控區(qū)(somatic ICRs， sICRs)[20]。gICR 指在精子和卵子中就建立的等位基因組序列的差異甲基化區(qū)域，并且gICR 在早期發(fā)育過程中不發(fā)生DNA 的去甲基化；而 sICR 是指只在體細胞中才建立起的等位基因組序列的差異甲基化區(qū)域[21]。哺乳動物早期胚胎的 去甲基化過程是區(qū)域特異性的，在此過程中許多區(qū) 域被保護并不去甲基化，從而使一些父源和母源差 異的甲基化區(qū)域(印跡區(qū)域)能夠維持下來，因此我 們推測選擇性地去甲基化方式可能是導致印跡基因形成的一個重要因素[18]。

生殖細胞發(fā)育過程中全基因組去甲基化及重新建立DNA甲基化圖譜。原始生殖細胞(primordial germ cells， PGCs)是能夠產(chǎn)生雄性和雌性生殖細胞的早期細胞。生殖細胞發(fā)育過程中經(jīng)歷了全基因組的去甲基化及重新建立DNA甲基化圖譜的過程。在小鼠的PGC發(fā)育過程中，發(fā)生了大規(guī)模的去甲基化過程。PGC在 6.5天時起始分化，在13.5天時，平均甲基化水平降至最低點，此時全基因組 DNA 的甲基化水平大約在 5%左右[18]。雄性的PGC細胞在13.5 天后開始重新建立甲基化圖譜，而雌性PGC重新甲基化的時間晚于雄性．經(jīng)過重新甲基化后，雄性生殖細胞的甲基化水平高于雌性生殖細胞，從而形成精子和卵子。人與小鼠的PGC發(fā)育過程 DNA 甲基化動態(tài)非常相似。由于發(fā)育周期不同，人妊娠10～11 周時，PGC的甲基化水平降至最低點，隨后進入重新甲基化過程[22]。研究[23]發(fā)現(xiàn)一部分與代謝和神經(jīng)性疾病相關的位點也在整體去甲基化的過程 中保留了甲基化修飾。

生殖細胞發(fā)育過程中的DNA甲基化重編程過程中，大部分區(qū)域的甲基化修飾被抹去并重新建立。兩輪重編程過程也存在著許多差異。首先，PGC發(fā)育過程相比早期胚胎發(fā)育過程的DNA去甲基化發(fā)生的更為徹底[24]。此外，兩輪 DNA甲基化重編程過程的差異主要體現(xiàn)在對印跡調(diào)控區(qū)的甲基化控制方面，gICRs 的等位基因特異甲基化的狀態(tài)在 PGC發(fā)育過程隨著去甲基化過程被消除，在隨后的重新甲基化過程中建立，但在早期胚胎發(fā)育的去甲基化過程中，gICRs甲基化的狀態(tài)得到維持[25]DNA 甲基化重編程對于個體發(fā)育的意義有：①從遺傳持續(xù)性的角度，在早期胚胎發(fā)育和原始生殖細胞發(fā)育過程中發(fā) 生的兩輪大規(guī)模 DNA甲基化重編程過程，其目的是為了消除親代在生存過程中產(chǎn)生的異常甲基化修飾，從而避免這些異常對于子代的影響[26]；②從細胞分化能力的角度，DNA甲基化對于細胞命運 決定具有重要意義，是一種限制細胞發(fā)育潛能的表 觀遺傳屏障．在生命循環(huán)的關鍵時期，如早期胚胎發(fā)育和原始生殖細胞發(fā)育時期，消除這種 DNA甲基化的屏障，有助于重新建立發(fā)育的潛能[27]；③從胚胎發(fā)育特點的角度，哺乳動物發(fā)育過程中兩輪 DNA 去甲基化有助于基因組印跡的形成，基因組印跡是有胎盤的哺乳動物所特有的，有助于調(diào)控胚 胎在母親子宮內(nèi)的體積．我們推測兩輪的全基因組 去甲基化是哺乳動物進化中的重要一步。

2.2 DNA甲基化在衰老過程中的變化

衰老的DNA甲基化模式為總體DNA甲基化水平降低，但某些特定區(qū)域DNA為高甲基化狀態(tài)[28]。人類DNA甲基化的表觀遺傳譜隨年齡增長不斷變化，在不同生活習慣和/或環(huán)境得雙胞胎中更是明顯[29]。這表明老化相關的DNA甲基化改變部分是由環(huán)境因素引起的。

年齡相關的低DNA甲基化主要發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)域[30]。相反，超甲基化通常發(fā)生在非甲基化的CGIs 。隨著年齡的增長，一些基因超甲基化也在癌癥細胞和其他年齡相關疾病中出現(xiàn)[31，32]。

生育力的下降與母親年齡增加有關，但生育力下降的具體相關機制仍不清楚?；蚪M印記在胚胎生長發(fā)育和胎盤功能中起著重要作用。而在卵母細胞和受精后早期的胚胎發(fā)育過程中會出現(xiàn)基因組印跡的缺陷。如果DNA甲基化缺陷發(fā)生在卵母細胞發(fā)育過程中，這些缺陷則會在后代中反應出來。Yue等[33]研究了年輕小鼠(6～8周)和老年小鼠(35～40周)的卵母細胞和植入前胚胎的DNA甲基化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著母體年齡的增加，卵母細胞和植入前胚胎的DNA甲基化水平顯著降低；此外，老年雌性小鼠的卵裂率、囊胚率以及妊娠率較年輕的雌性小鼠低。與母體衰老相關的生育力下降可能由卵子發(fā)生過程中的DNA甲基化缺陷和胚胎著床前發(fā)育的缺陷所致。然而，表觀遺傳評價結(jié)果表明，印跡基因H19和SNRPN在受精后3.5天的卵裂球中正常表達，此外，該基因還顯示在受精后10.5天的胚胎及其相應胎盤中表達單等位基因。在印跡基因SNRPN、KCNQ1OT1、U2AF1-RS1、PEG1、IGF2R和H19的DMRS(差異甲基化區(qū))的甲基化，以及胚胎和胎盤的全基因組DNA甲基化水平在高齡女性中沒有改變。數(shù)據(jù)表明，能夠發(fā)育到中期妊娠的胚胎能獲得和維持正常的DNA甲基化模式?？偠灾阁w老化對卵子發(fā)育和受精卵植入前發(fā)育過程中的全基因甲基化有不利影響。相比之下，盡管在高齡女性中期妊娠期的不良結(jié)局增加，但在相同時期，甲基化印記在活胎中正常維持。

綜上所述，DNA甲基化與衰老有關。DNA甲基化的生物學特征主要有Dnmts、CpG島及DNA去甲基化。人及其他哺乳動物的早期胚胎 DNA 甲基化動態(tài)為配子高甲基化、胚胎低甲基化。生殖細胞發(fā)育過程中伴隨全基因組去甲基化及重新建立DNA甲基化圖譜。隨母體年齡增加，DNA甲基化水平降低，導致生育力下降。隨著DNA甲基化檢測技術的發(fā)展，特別是全基因組區(qū)域內(nèi)DNA甲基化的可量化分析，與衰老相關的甲基化標記不僅在基礎醫(yī)學研究中，在臨床研究中也將發(fā)揮重要作用，如可用來監(jiān)測健康狀況并預測壽命，找到有效的藥物改善衰老機體的功能，靶向治療相關腫瘤，提高高齡女性的生育能力等。