缺血后處理減輕大鼠后肢缺血再灌注后肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

楊軍，胡新華，范玥堯，何家安，衣正貴，張強(qiáng)

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院外科，沈陽(yáng) 110001；2.遼陽(yáng)市太子河醫(yī)院 外科，遼寧 遼陽(yáng) 111000）

周圍血管手術(shù)、腹主動(dòng)脈瘤、斷肢再植或周圍血管損傷等疾病治療過程均不可避免地造成肢體缺血。盡快恢復(fù)充足的血供是缺血肢體組織成活的關(guān)鍵，然而缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷能夠?qū)е逻h(yuǎn)隔器官（如肺、腎、小腸等）的功能損害［1］。缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IPC）能夠減輕肢體缺血再灌注后肺損傷，其作用機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhension molecule-1，ICAM-1） 介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）在肺組織內(nèi)的黏附、浸潤(rùn)而實(shí)現(xiàn)的［2］。近來(lái)，人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)缺血后處理（ischemic postconditioning，I-postC）同樣能提高機(jī)體對(duì)缺血的耐受性［3］。本研究觀察I-postC對(duì)大鼠雙側(cè)后肢I(xiàn)/R模型肺損傷的影響，探討其作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

48 只雄性 Wistar大鼠，（250±50）g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為I/R組、IPC組及I-postC組（n=16），每組再隨機(jī)分為12 h或24 h兩個(gè)亞組（n=8）。2%戊巴比妥鈉40 mg/kg行腹腔麻醉，腹部正中切口、分離腎下腹主動(dòng)脈。I/R組采用無(wú)創(chuàng)性血管夾夾閉腹主動(dòng)脈4 h，之后移去動(dòng)脈夾恢復(fù)血流再灌注12 h或24 h。IPC組采用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈5 min，開夾再灌注5 min，反復(fù)3輪進(jìn)行缺血預(yù)處理，然后按I/R組程序操作。I-postC組采用無(wú)創(chuàng)性血管夾夾閉腹主動(dòng)脈4 h后，開夾再灌注1 min，夾閉1 min，反復(fù)3輪進(jìn)行缺血后處理，然后開夾徹底恢復(fù)血流灌注，分別于再灌注12 h或24 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)。各組分別在12 h、24 h取材雙肺，液氮中快速冷凍后置-70℃冰箱中保存。

1.2 組織學(xué)研究

取部分肺葉固定、包埋，制成4μm厚切片，蘇木素-伊紅HE染色。計(jì)數(shù)肺泡間隔中的PMN數(shù)代表肺部扣押的PMN，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，取平均數(shù)。

1.3 肺組織濕/干重比

取部分肺標(biāo)本稱重，然后置入真空干燥器中50°C烘烤24 h，稱量組織重量。24 h后重復(fù)，確定脫水完全。計(jì)算肺組織濕/干重比率作為肺水腫的標(biāo)志。

1.4 肺組織丙二醛和髓過氧化物酶的檢測(cè)

收集右肺上葉，按肺組織丙二醛（malondialdehyde，MDA） 和 髓 過 氧 化 物 酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（購(gòu)于南京建成公司）說明書檢測(cè)肺組織中的MDA和MPO含量。

1.5 半定量RT-PCR

采用Trizol提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR引物序列如下：ICAM-1上游引物：5′-TGCGTTTTGGAGCTAGCGGACCA-3′，下游引物：5′-CGAGGACCATACAGCACGTGCAG-3′（321 bp）；βactin 上游引物：5′-TTGTAACCAACTGGGACGATA-3′，下游引物：5′-GATCTTGATCTTCATGGTGCT-3′（608 bp）。PCR 條件：94℃變性 2 min，94°C30 s，56°C 30 s，72°C 60 s，共 30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 7 min。電泳后凝膠成像系統(tǒng)上攝像并分析各條帶吸光度值。

1.6 原位雜交

肺組織標(biāo)本置于含0.1%的4%多聚甲醛溶液中固定2 h，梯度蔗糖脫水，OCT包埋后冷凍切片。ICAM-1 mRNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。正常靜脈作對(duì)照，PBS代替探針作陰性對(duì)照。光鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot蛋白印跡

剪碎肺組織后置于裂解液中機(jī)械勻漿，4℃低溫10 000 r/min離心10 min。Coomassie Plus試劑盒測(cè)總蛋白質(zhì)濃度。制備10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加蛋白樣品50μg，電泳后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗ICAM-1或actin（1∶1 000，山羊多克隆 IgG，Santa Cruz），4℃過夜，1∶1 000加入過氧化物酶標(biāo)記的馬抗山羊IgG-HRP 60 min，洗膜后加入ECL 1 min，暗室顯影2~3 min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，計(jì)算吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)變化

再灌注12 h或24 h后I/R組有明顯的彌散功能障礙，表現(xiàn)為間質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞增多并伴有明顯水腫。IPC和I-postC組與I/R組比較，上述各種表現(xiàn)明顯減輕，PMN計(jì)數(shù)顯著減少（P<0.01）。見表1。

表1 肺PMN計(jì)數(shù)、濕/干重比、MDA和MPO活性、ICAM-1表達(dá)比較（x±s）Tab.1 The changes of PMD counts，M/D ratio，MDA and MPO activity and expression of ICAM-1 in lung（x±s）

2.2 肺組織濕/干重比、MDA和MPO的檢測(cè)

IPC組和I-postC組與I/R組比較，肺組織濕/干重比（W/D）明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。但是，IPC和I-postC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；IPC組和I-postC組與I/R組比較，肺組織MDA和MPO活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。IPC組和I-postC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 半定量RT-PCR和原位雜交結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果提示在I/R組12 h和24 h肺組織中ICAM-1 mRNA均有明顯表達(dá)，而IPC和I-postC均能夠顯著抑制ICAM-1 mRNA表達(dá)。原位雜交提示ICAM-1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在支氣管和肺泡。見表1。

2.4 Western blot蛋白印跡

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：分別于108 kDa和43 kDa對(duì)應(yīng)處出現(xiàn)ICAM-1和actin蛋白表達(dá)信號(hào)。I/R組在12 h及24 h的表達(dá)均很強(qiáng)，而IPC組和I-postC組的蛋白表達(dá)信號(hào)均顯著弱于I/R組（圖1，表1）。

3 討論

多種外科操作，包括下肢血管重建以及應(yīng)用止血帶的手術(shù)，均可以使肢體產(chǎn)生缺血再灌注損傷。再灌注損傷能夠啟動(dòng)系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征，產(chǎn)生大量炎性介子、激活血循環(huán)中的PMN。肺部微血管中的白細(xì)胞扣押及PMN激活是急性肺損傷的關(guān)鍵［4］。因此，清除或減少PMN對(duì)此類疾病導(dǎo)致的肺損傷有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，I-postC和IPC均能夠減少肺MDA含量，而MDA是反映脂質(zhì)過氧化和氧自由基介導(dǎo)細(xì)胞損傷的標(biāo)志。MPO作為肺PMN浸潤(rùn)的標(biāo)志，I-postC和IPC后亦明顯減少。我們推測(cè)二者均可能通過阻止ICAM-1基因的介導(dǎo)和參與來(lái)減輕肺損傷。

由于缺血性疾病的發(fā)生往往難以預(yù)知，使IPC的應(yīng)用受到很大的限制。I-postC能在缺血發(fā)生后、再灌注之前進(jìn)行，比IPC具有更為廣闊的臨床應(yīng)用前景。許多學(xué)者采用不同動(dòng)物的在體或離體心臟模型對(duì)比I-postC和IPC對(duì)I/R損傷的保護(hù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)二者存在相似之處：均有利于恢復(fù)心功能、縮小心肌梗死范圍，減少心律失常的發(fā)生率［5］。新近研究表明［6］，I-postC能夠保護(hù)動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞功能，減輕中性粒細(xì)胞聚集，而IPC則沒有這一作用，提示I-postC和IPC之間可能存在本質(zhì)區(qū)別。本研究結(jié)果證實(shí)，I-postC能夠顯著減輕雙側(cè)后肢I(xiàn)/R所致急性肺損傷，與抑制ICAM-1的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有關(guān)。因此，I-postC在急性呼吸窘迫綜合征或其他以中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷疾病中可能發(fā)揮重要的治療或預(yù)防作用。

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