丙戊茶堿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制

王鐵東，王秋石，王俊科

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院麻醉科，沈陽 110032；2.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain）是外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變或損傷引起的疼痛［1］，常見的有糖尿病型神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、脊髓損傷后神經(jīng)痛以及各種損傷、炎癥或手術(shù)后遺留的神經(jīng)痛，這些疾病的共同特點是它不同于由于組織損傷而導(dǎo)致的急性疼痛，通常呈慢性、可持續(xù)數(shù)日或數(shù)月。丙戊茶堿（propentofylline）能透過血腦屏障，具有細(xì)胞膜穩(wěn)定的作用，目前在實驗研究中認(rèn)為丙戊茶堿是膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑，是通過抑制磷酸二酯酶從而增強(qiáng)cAMP的信號傳導(dǎo)途徑來降低中樞的敏感性，主要是對膠質(zhì)細(xì)胞的激活和前炎性細(xì)胞因子釋放的抑制作用。此外丙戊茶堿還是腺苷“重攝取”的阻滯劑［2］，而后者可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的分裂。本實驗觀察丙戊茶堿對坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（spared nerve injury，SNI）模型大鼠痛閾的影響和脊髓中炎性細(xì)胞因子及腺苷受體（adenosine receptor，AR）的變化，以探討丙戊茶堿對神經(jīng)病理性疼痛的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組

雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量（250±20）g。本實驗嚴(yán)格按照國際疼痛學(xué)會（IASP）關(guān)于應(yīng)用清醒動物進(jìn)行疼痛實驗研究綱要的要求來實施和完成。

大鼠隨機(jī)分為4組，假手術(shù)（Sh）組、模型（S）組、鞘內(nèi)注射丙戊茶堿（P1）組及腹腔注射丙戊茶堿（P2）組，每組24只。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)，不牽拉和損傷神經(jīng)。其中S組和P1組造模后分別單次鞘內(nèi)注射鹽水20μl和丙戊茶堿20μl（0.05μg/μl）；P2組造模后單次腹腔內(nèi)注射丙戊茶堿1ml（1 mg/kg），鹽水和藥物的應(yīng)用至取材點。各組分別在術(shù)前1 d 及術(shù)后 1，3，7，14，21 d 的上午測量行為學(xué)指標(biāo)，并于術(shù)后1，7，14，21 d處死大鼠，并取大鼠腰段脊髓測定炎性細(xì)胞因子和腺苷A1受體（A1-AR）的含量。每組每個時間點各取6只大鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 坐骨神經(jīng)分支SNI模型制備：參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行制備。

1.2.2 鞘內(nèi)注藥的方法：參照Mestre等［4］方法進(jìn)行。

1.2.3 機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）測量法［5］：用 von-Frey 纖維分別刺激大鼠足底部位，保持垂直，加力，致纖毛出現(xiàn)彎曲，持續(xù)時間≤4 s。大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性行為，刺激強(qiáng)度首先從8 g開始，如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激。如此連續(xù)進(jìn)行，直到出現(xiàn)第1次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測定4次。每次刺激間隔15 s。出現(xiàn)2/3次縮足反應(yīng)的最低力度值為測量結(jié)果。

1.2.4 熱縮足反射持續(xù)時間（thermal withdrawal duration，TWD）測量法［6］：按 Hargreaves法用 BME-410型熱痛刺激儀對準(zhǔn)大鼠足底緊貼玻璃板部位。刺激光強(qiáng)度設(shè)置為能使正常大鼠在12~15 s左右發(fā)生縮足反應(yīng)的強(qiáng)度，同時為避免大鼠足底的燙傷，熱刺激時間的上限設(shè)定為30 s。當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足反射時立即按下秒表計時，待縮足反射消失時停止計時，從出現(xiàn)縮足反應(yīng)到縮足反應(yīng)消失的時間即為熱縮足反射維持時間（s）。

1.2.5 細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的測定：在各時間點將大鼠深麻醉（戊巴比妥鈉100 mg/kg）后，迅速截取脊髓腰膨大，將脊髓組織用微量研磨器磨碎制成勻漿液，將勻漿液進(jìn)行30倍稀釋后用ELISA試劑盒檢測，按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.6 A1-ARWestern-Blot法檢測：取脊髓腰膨大并快速置入-80℃冰箱保存待用。稱取100 mg脊髓標(biāo)本，冰上剪碎后，加入1 ml勻漿液，冰上孵育30 min，再4℃20 000 g離心30 min，沉淀以緩沖液懸浮，4℃振蕩混勻，再4℃20 000 g離心20 min，取上清，蛋白定量，灌制8%SDS-PAGE凝膠，每孔上樣量50μl進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)膜，3%牛血清封閉3 h后，與A1-AR一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST沖洗15 min×3次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫震蕩孵育 1.5 h，TBST沖洗 15 min×3次，用NBT/BCIP試劑盒顯色，用自動電泳凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，然后用Scion Image軟件對免疫印跡條帶進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5軟件處理，組間比較用方差分析，P<0.05認(rèn)為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)前各組大鼠的兩種疼痛行為學(xué)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；S組從術(shù)后1 d開始患足的MWT值即出現(xiàn)顯著下降，TWD值明顯延長，與術(shù)前基礎(chǔ)值和Sh組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且這種變化趨勢持續(xù)至術(shù)后21 d。P1組和P2組能使大鼠患足MWT值的下降幅度及TWD值的上升幅度減少，與S組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；而且P1組對大鼠MWT和TWD值的影響優(yōu)于P2組，其結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 脊髓水平TNF-α和IL-1β表達(dá)量的變化

與術(shù)前基礎(chǔ)值和Sh組比較，S組脊髓的細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的含量明顯增加，在術(shù)后1 d起就開始增高，于術(shù)后7 d達(dá)到高峰，14 d時仍然較高（P<0.05），于術(shù)后21 d明顯下降，與之相比較，其中P1、P2組與S組比較TNF-α和IL-1β增加的幅度小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表1 各組大鼠術(shù)前及術(shù)后MWT和TWD的變化（x±s）Tab.1 Changes in MWT and TWDbefore and after operation in each group（x±s）

2.3 大鼠脊髓A1-AR的實驗結(jié)果

SNI模型使大鼠脊髓腺苷A1受體的表達(dá)有較明顯的降低，于術(shù)后1 d開始其蛋白表達(dá)量下降，并持續(xù)至術(shù)后21 d，與Sh組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。P1組和P2組能使脊髓A1受體的表達(dá)增加，與S組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表2 各組大鼠術(shù)后脊髓TNF-α和IL-1β含量的變化（x±s）Tab.2 Changes in the levels of TNF-α and IL-1β after operation in each group（x±s）

3 討論

中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的改變及細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的改變在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生與維持起著關(guān)鍵的作用。在慢性炎癥及神經(jīng)損傷引起的傷害性感受中，大量的膠質(zhì)細(xì)胞被激活，直接或間接地產(chǎn)生一些炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子，從而加強(qiáng)神經(jīng)病理性疼痛的形成。對強(qiáng)啡肽誘導(dǎo)異常性疼痛發(fā)生的小鼠鞘內(nèi)注射IL-1受體拮抗藥（IL-1ra）、IL-10或NF-κB抑制藥等，均可緩解異常性疼痛［7］。因此認(rèn)為在脊髓水平調(diào)整細(xì)胞因子的活性可能是治療慢性疼痛的有效措施。

本實驗采用大鼠SNI模型，模擬了臨床神經(jīng)病理性疼痛的多個特點。結(jié)果大鼠在術(shù)后1 d就表現(xiàn)出明顯的機(jī)械痛敏和熱痛敏，熱痛敏表現(xiàn)為熱縮足反射維持時間延長，提示SNI模型早期即出現(xiàn)了中樞（脊髓）敏化。在SNI模型中，炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β含量的變化，于術(shù)后7 d達(dá)到高峰。使用丙戊茶堿后能夠明顯地改善機(jī)械痛敏和熱痛敏反應(yīng)，并且也能明顯抑制炎性細(xì)胞因子的釋放。有研究顯示，增強(qiáng)的依賴性cAMP信號系統(tǒng)增加了抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)［8］。因此，認(rèn)為丙戊茶堿可能是增強(qiáng)了抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生并依次下調(diào)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生也導(dǎo)致了病理性膠質(zhì)細(xì)胞的激活，不僅加重了繼發(fā)的神經(jīng)元損傷，而且也增加了中樞的敏感性和行為學(xué)的痛敏。

表3 全組術(shù)后各時點A1-AR表達(dá)的相對光密度值（x±s）Tab.3 Relative optical density of the expression of adenosine A1 receptor after operation in each group（x±s）

丙戊茶堿也是腺苷再攝取的抑制劑。臨床研究發(fā)現(xiàn)同樣遭受神經(jīng)損傷的患者卻擁有不同程度的病理性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛較嚴(yán)重的患者其腦脊液中腺苷的水平較低［9］。在實驗中鞘內(nèi)給予腺苷降低了由芥子油繼發(fā)的痛敏程度。腺苷是由脊髓的A1-AR介導(dǎo)的，本研究中A1-AR蛋白含量的表達(dá)在SNI模型中降低，丙戊茶堿作用后其含量的表達(dá)有增強(qiáng)的趨勢。表明A1-AR在病理性疼痛中發(fā)揮了作用，然而丙戊茶堿是直接作用于A1-AR還是間接對受體起作用，以及受體功能如何改變，尚需進(jìn)一步研究。

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