HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地鬼臼類藥材中鬼臼毒素的含量

趙祖興，楊光義，陳吉炎，葉方，郝新才

（1.湖北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢市 430061；2.鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院，十堰市 442000）

在我國(guó)，鬼臼類藥材包括小檗科鬼臼亞科Dysosma versipellis（Hance.）M.Cheng Podophylloideae桃兒七屬 Sinopodophyllum、山荷葉屬Diphylleia、八角蓮屬Dysosma等3個(gè)屬，各屬代表藥用植物分別有桃兒七S.hexandrum（S.emodi（Wall.ex Royle）Ying）、南方山荷葉D.sinensis H.L.Li以及八角蓮D.versipellis（Hance）M.Cheng。鬼臼類藥材主要以干燥根莖入藥[1]。主要成分鬼臼毒素為芳基四氫萘類木質(zhì)素，具有抗腫瘤、抗病毒等活性[2]，以及祛風(fēng)除濕、活血止痛、鎮(zhèn)咳平喘等功能[3]。鬼臼類藥材因其多種植物來源而導(dǎo)致異名繁多、品種混用現(xiàn)象比較嚴(yán)重，屢有因用法用量問題而引發(fā)中毒事件[4]。鬼臼毒素為其主要毒性成分，不同產(chǎn)地藥材中鬼臼毒素含量差異較大，鬼臼類藥材飲片中毒劑量從幾克到幾十克不等[5]。為了比較不同產(chǎn)地鬼臼類藥材的毒性大小，本試驗(yàn)用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定不同產(chǎn)地鬼臼類藥材中鬼臼毒素的含量，以為臨床安全合理用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000型HPLC儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器（美國(guó)戴安公司）；Chromeleon軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

甲醇為色譜純，水為純化水，氯仿、磷酸二氫鉀為分析純；鬼臼毒素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111645-200301）；鬼臼類藥材分別采于湖北、重慶、云南等地，由鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系生藥教研室陳吉炎教授提供并鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取各樣品粉末（過2號(hào)篩）1 g，置于250 mL錐形瓶中，加氯仿50 mL，回流提取1 h，過濾，濾液揮干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?0 mL容量瓶中，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12 h的鬼臼毒素對(duì)照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），前加預(yù)柱（10 mm×4.6 mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇-0.1 mol·L-1磷酸二氫鉀（45∶55）；流速：1.0 mL·min-1。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.鬼臼毒素對(duì)照品；B.供試品Fig 1 HPLC chromatogramsA.podophyllotoxin control；B.test sample

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察：精密量取鬼臼毒素對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，鬼臼毒素含量（X）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝85.2859X+1.6881（r＝0.9998）。結(jié)果表明，鬼臼毒素的進(jìn)樣量在0.156～1.3 mg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)：精密吸取鬼臼毒素對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.0026%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，分別于配制后0、2、5、8、10 h進(jìn)樣。結(jié)果，RSD＝0.0114%（n＝5），表明供試品溶液在10 h內(nèi)檢測(cè)對(duì)結(jié)果無影響，穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)：按“2.5”項(xiàng)下方法操作，對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定6次，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL。結(jié)果，RSD＝0.42%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已測(cè)含量的樣品，分別精密加入低、中、高濃度的對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，其平均回收率為100.06%，RSD＝1.99%，說明該測(cè)定方法可行。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.5 樣品含量測(cè)定

精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL進(jìn)樣，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算鬼臼毒素含量。藥材樣品來源、編號(hào)及鬼臼毒素含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3 討論

10批樣品的測(cè)定結(jié)果表明，鬼臼毒素含量最多的依次是產(chǎn)地湖北竹溪的南方山荷葉、產(chǎn)地重慶的南方山荷葉、產(chǎn)地云南的南方山荷葉，含量最少的是產(chǎn)地湖北房縣的六角蓮。

不同產(chǎn)地、不同品種的鬼臼類藥材所含鬼臼毒素差異較大，故用生藥材入藥時(shí)，各種藥材的中毒劑量也有差異。

[1]馬紹賓，胡志浩.小檗科鬼臼亞科的地理分布與系統(tǒng)發(fā)育[J].云南植物研究，1997，19（1）：48.

[2]尚明英，徐珞珊，李 萍，等.鬼臼類中藥及其木脂素類成分的藥效學(xué)研究[J].中草藥，2002，33（8）：722.

[3]肖培根編.新編中藥志（第1卷）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：1.

[4]張三全，曾 抗，李國(guó)峰，等.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)脂質(zhì)體鬼臼毒素外用的安全性觀察[J].臨床皮膚科雜志，2003，32（4）：188.

[5]楊光義，杜士明，黃良永，等.鬼臼類中藥毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2008，19（36）：2872.