食用油中DNA提取方法的研究進(jìn)展*

張海亮，吳亞君，陳銀基，鞠興榮，陳穎

1(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100123) 2(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京，210003)

食用油中DNA提取方法的研究進(jìn)展*

張海亮1，2，吳亞君1，陳銀基2，鞠興榮2，陳穎1

1(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100123) 2(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京，210003)

利用基于DNA的分子生物學(xué)手段對(duì)食用油進(jìn)行品種鑒定、摻假檢測(cè)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，而其瓶頸就是DNA提取。DNA提取是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)，能否提取到高質(zhì)量的DNA，是食用油研究的關(guān)鍵。文中從樣品的前處理、裂解和分離、DNA富集和純化3個(gè)方面分別介紹了幾種常用的食用油中DNA提取方法，并對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。

食品安全，食用油，DNA提取

近年來，隨著食品安全事故的頻發(fā)，食品安全越來越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。食用油安全是食品安全的重要內(nèi)容之一。食用油摻假摻雜不僅威脅著人們的身體健康，而且侵犯消費(fèi)者利益，影響消費(fèi)信心，不利于食用油產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)食用油進(jìn)行品種鑒定及摻假檢測(cè)是新發(fā)展起來的一種檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)方法的理化檢測(cè)和儀器分析檢測(cè)相比(如測(cè)定過氧化值、脂肪酸比例、色譜分析等)，具有檢測(cè)靈敏度高、可靠性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單和省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)。

運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)食用油進(jìn)行品種鑒定及摻假檢測(cè)，首要前提是從油脂中提取出適合PCR擴(kuò)增的DNA。由于精煉食用油生產(chǎn)需經(jīng)過高溫及高壓等處理，其中的DNA降解為大小不一的碎片，且含量極低，這給DNA提取造成了很大困難。因而DNA提取技術(shù)成為食用油PCR檢測(cè)技術(shù)的瓶頸，是食用油檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵所在。

國(guó)際上研究人員一直在努力探索食用油中DNA的提取技術(shù)。例如Pauli等［1］從粗制大豆油中提取DNA，但這種方法并不適合精煉植物油。另外有很多關(guān)于從橄欖油中成功提取DNA的報(bào)道［2－5］，主要原因是初榨橄欖油不經(jīng)過精煉，極大地避免DNA的破壞和損失。1997年Maja Hellebrand等［6］首次從精煉菜籽油中提取到菜籽DNA，并證明可用于物種鑒定。2010年Joana Costa等［7］利用改良的試劑盒法從精煉植物油中提取大豆DNA，這是國(guó)外第一次報(bào)道從精煉植物油中檢測(cè)到大豆DNA。

國(guó)內(nèi)也有學(xué)者建立了食用油中DNA提取的方法。覃文等［8］在2002年就對(duì)油脂中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)進(jìn)行了初步研究，并對(duì)市售的食用油進(jìn)行了DNA提取，利用PCR-GeneScan技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，且檢測(cè)到植物內(nèi)源基因。2004年金紅等［9］對(duì)大豆色拉油中DNA的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，采用PCR檢測(cè)出大豆的外源基因。徐偉麗等［10］通過試劑盒改良，建立了一種穩(wěn)定有效、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的油脂中DNA提取方法。白立群等［11］利用冷凍干燥技術(shù)對(duì)含有DNA的水相進(jìn)行濃縮，建立了一種油脂中DNA提取的新方法，可用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)外在食用油中DNA提取方面所考慮的技術(shù)要點(diǎn)主要包括:(1)樣品的前處理;(2)裂解和分離;(3)DNA富集和純化。本文將針對(duì)這3個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)對(duì)目前的食用油中DNA提取方法進(jìn)行介紹。

1 樣品前處理

由于食用油是一種高度加工和純化的產(chǎn)品，為了盡可能多的從油脂中分離殘留的DNA分子，合理地對(duì)樣品進(jìn)行萃取和濃縮是必要的。目前常用的前處理方法是乳化法和濃縮法。

1.1 乳化法

將油相與水相或有機(jī)相進(jìn)行充分的乳化處理，使油脂中的DNA保留在水相中，是提取DNA的關(guān)鍵。Clarissa Consolandi等［12］將橄欖油與正己烷混合，充分乳化后離心，并用含有吐溫的裂解液和蛋白酶K分別處理上清和沉淀，經(jīng)孵育和離心后，各分離相用預(yù)冷的異丙醇沉淀DNA，并用體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇清洗，最后將DNA溶解于水中。實(shí)驗(yàn)利用多重PCR對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法不僅效率高，而且成本低，樣品量小，僅需2mL橄欖油，便可提取到50μL總量為1.35μg的DNA，比Wizard試劑盒的起始檢測(cè)油量低50倍。Maria等［13］在此法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將CTAB裂解液和正己烷等體積混合，并在60℃條件下與橄欖油充分乳化，提取結(jié)果顯示改良的乳化法顯著優(yōu)于CTAB法和正己烷法。

1.2 濃縮法

由于精煉油經(jīng)過復(fù)雜的處理后DNA含量極少，因此如果能用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒑蠨NA的大量水相進(jìn)行濃縮，將大大提高后續(xù)的提取效果。白立群等［11］建立了一種有效的大豆精煉油DNA提取方法——冷凍干燥法。冷凍干燥法將食用油與水充分乳化，利用冷凍干燥技術(shù)將水分完全蒸發(fā)，再使用CTAB裂解液從沉淀中提取和分離DNA。采用該方法從5種市售一級(jí)大豆油中提取DNA，成功檢測(cè)到大豆內(nèi)源Lectin基因、外源CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子。

2 裂解和分離

DNA提取中常用的裂解液主要有CTAB、SDS、異硫氰酸胍等，基本原理是通過裂解液裂解細(xì)胞并分離DNA，利用酚/三氯甲烷等有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，并加入異丙醇或乙醇等沉淀DNA，最終用TE緩沖液或雙蒸水溶解DNA。目前常用的裂解和分離方法適合于動(dòng)植物及微生物中DNA的提取，因此根據(jù)食用油組成及理化性質(zhì)的不同，需要對(duì)已有的方法進(jìn)行改良。

2.1 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法

CTAB法被廣泛的應(yīng)用于植物葉子、種子、微生物以及加工食品中的DNA提取，是一種經(jīng)典的DNA提取方法［14－15］。其基本原理是:CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使DNA與多糖等雜質(zhì)分開，再用乙醇沉淀DNA 而除去 CTAB。自從 Murray等人［16－17］首次使用CTAB法成功的提取植物基因組DNA，CTAB發(fā)展迅速，不斷得到改進(jìn)，已經(jīng)成為分子生物學(xué)中提取DNA 的最常用的方法之一［18－20］。

根據(jù)食用油的性質(zhì)和特點(diǎn)，經(jīng)改良后的CTAB法更加適合食用油DNA的提取。Innocenzo Muzzalupo［4］利用CTAB法從橄欖油中提取 DNA，添加了蛋白酶K，并向CTAB提取緩沖液中加入2%的巰基乙醇，不僅能使蛋白質(zhì)充分變性，還能夠保護(hù)DNA的完整性，使提取的DNA更適合進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增。Matteo Busconi［21］等通過提高 CTAB 的濃度，并使用三氯甲烷/辛醇代替三氯甲烷/異戊醇抽提，提高了橄欖油中DNA的提取效率。王亞等［22］通過向CTAB提取緩沖液中加入PVP和巰基乙醇，經(jīng)酚/三氯甲烷抽提，最后用異丙醇和醋酸銨沉淀油脂中DNA，取得了不錯(cuò)的效果。

CTAB法提取DNA成本較低，不需要昂貴儀器和試劑，操作簡(jiǎn)單，具有普遍的適用性。但該法比較耗時(shí)，容易造成提取過程中DNA的損失，而且提取過程中用到酚、三氯甲烷等有毒試劑，因此CTAB法在食用油DNA提取方面還具有一定的局限性。

2.2 SDS(十二烷基磺酸鈉)法

SDS法也是一種分子生物學(xué)中常用的DNA提取方法。與CTAB不同，SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析、蛋白變性，同時(shí)SDS能與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成復(fù)合物，釋放出核酸。通過提高鹽濃度并降低溫度，使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的溶解度變得更小，從而使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀。上清液經(jīng)酚/氯仿反復(fù)抽提后用乙醇沉淀DNA。

傳統(tǒng)的SDS提取緩沖液，包含Tris-HCl，EDTA，NaCl，巰基乙醇和 SDS［23］。SDS 法最初也主要用于植物DNA的提?。?4］。在后來的應(yīng)用中，SDS法經(jīng)過一步步改良，不斷完善，所獲得的DNA質(zhì)量和產(chǎn)量也逐漸提高，已經(jīng)成為DNA提取的一種較好的方法。

根據(jù)食用油的特點(diǎn)和性質(zhì)，Maja Hellebrand［6］等利用SDS法成功的從精煉菜籽油中提取到菜籽DNA。他們首先向預(yù)處理后的菜籽油加入SDS提取液，并添加蛋白酶K，后經(jīng)酚/氯仿抽提，最后用乙醇沉淀DNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在粗制油和精煉菜籽油中均可以提取到DNA，并能成功進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。許冬倩［25］等對(duì)SDS法進(jìn)行改良，省去了酚/三氯甲烷抽提步驟，減少了大豆油DNA的損失，提取的DNA含量高，質(zhì)量也足以保證PCR反應(yīng)的要求。

SDS法操作簡(jiǎn)單而且比較溫和，也可提取到高分子量的DNA，但所得到的產(chǎn)物含雜質(zhì)較多，有一些報(bào)道稱用SDS法提取的DNA的純度不如CTAB法提取的高［26－28］。

2.3 異硫氰酸胍(GuSCN)法

異硫氰酸胍是一種蛋白質(zhì)變性劑，它能使細(xì)胞結(jié)構(gòu)迅速被破壞，使核酸從細(xì)胞中釋放出來。同時(shí)高濃度的異硫氰酸胍還使細(xì)胞內(nèi)的核酸酶失活，使釋放出的核酸不被降解。

異硫氰酸胍除了用于一般動(dòng)植物DNA的提取之外，還可用于食用油等深加工產(chǎn)品的DNA提取。Simona Pafundo［29］等使用 Nucleospin Plant試劑盒提取橄欖油中的 DNA，并將提取的 DNA成功的用于AFLD分析，而該試劑盒的裂解液中的主要成分之一為異硫氰酸胍。Wizard試劑盒裂解液中也含有異硫氰酸胍成分。覃文等［8，30］使用Wizard試劑盒提取食用油中的DNA，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)出大豆內(nèi)源基因Lectin以及外源抗除草劑基因EPSPS，成功的為食用油脂進(jìn)行核酸類生物性檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)捷有效的方法。徐偉麗等［10］針對(duì)色拉油中DNA含量低，破壞嚴(yán)重的特點(diǎn)，采用Wizard基因組純化試劑盒成功檢測(cè)出大豆的內(nèi)源基因、抗除草劑基因等。María José Chapela［31］等曾利用 Wizard DNA 純化試劑盒提取金槍魚罐頭中DNA，結(jié)果顯示提取的金槍魚DNA質(zhì)量良好，并成功地用于PCR擴(kuò)增。

3 DNA富集和純化

3.1 磁珠法

磁珠法的核心是將細(xì)胞中游離出來的核酸分子吸附到磁性顆粒表面，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附而留在溶液中。在磁場(chǎng)作用下，使磁性顆粒與液體分開，回收顆粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脫液洗脫即可以得到純凈的DNA。

磁珠法提取的DNA純度好，質(zhì)量高，已經(jīng)被用于多種復(fù)雜及深加工食品的DNA提取。Catherine［32］等對(duì)比Wizard試劑盒磁珠，硅膠和羥基磷灰石3種材料吸附提取橄欖油中的DNA，提取發(fā)現(xiàn)Wizard磁珠試劑盒法對(duì)橄欖油DNA提取效果最好，提取的DNA可用于微衛(wèi)星分析。Wu［2］等比較了Wizard磁珠純化試劑盒和CTAB法對(duì)大豆油DNA的提取效率，發(fā)現(xiàn)磁珠法提取DNA的lectin基因擴(kuò)增效率更高。

磁珠法提取的DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠，而且磁珠法不需要離心、不需要加入多種試劑，操作簡(jiǎn)單，符合核酸自動(dòng)化提取要求，是未來核酸純化方法發(fā)展的一個(gè)重要方向。

3.2 離心柱法

離心柱法是將樹脂或硅膠膜固定在離心管中，在高鹽低pH值條件下，DNA選擇性吸附于離心柱內(nèi)的樹脂或膜上，通過漂洗、離心等步驟，去除蛋白和多糖雜質(zhì)，最后用低鹽高pH值的洗脫緩沖液將DNA從樹脂或硅膠膜上洗脫。

Joana Costa等［7］使用以離心柱法為原理的 Nucleospin DNA提取試劑盒從精煉油中提取到大豆DNA。Joana等［33］用 Nucleospin DNA 提取試劑盒成功地從大豆油精煉過程中堿煉、水洗、脫色、脫臭等各個(gè)環(huán)節(jié)的油脂產(chǎn)物中提取到高質(zhì)量的DNA。Innocenzo Muzzalupo［5］等使用 QIAamp DNA 離心柱提取試劑盒提取橄欖油中DNA，能夠用于微衛(wèi)星分析，進(jìn)行橄欖油品種的鑒別。Rayda Ben Ayed［3］等比較了QIAamp DNA提取試劑盒，Wizard基因組純化試劑盒和CTAB法對(duì)橄欖油中DNA的提取效果，發(fā)現(xiàn)QIAamp DNA試劑盒提取DNA的效果最好，能夠用于物種鑒定。

欒鳳俠等［34］針對(duì)食用油脂中提取高純度和高得率DNA比較難的問題，通過對(duì)以離心柱為原理的試劑盒進(jìn)行改良，用離心柱法從食用油脂中提取到了純度和濃度均比較高的DNA，并用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)成功地檢測(cè)出了食用油脂中的內(nèi)源基因和外源基因。程紅梅等［35］通過將油和正己烷充分乳化，使殘存在油中的DNA交換到緩沖液中，并用自制的離心柱純化富集DNA，成功從大豆油中提取DNA。

3.3 擔(dān)體法

在食用油DNA提取過程中，通過添加一定量的DNA或RNA等物質(zhì)作為擔(dān)體，能夠提高DNA的提取效率，而且不對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。擔(dān)體DNA或RNA一般都在沉淀DNA之前加入，而且擔(dān)體DNA或RNA的選擇，最好選擇與目標(biāo)DNA的物種相差較遠(yuǎn)的植物、動(dòng)物或微生物DNA或RNA。

王彭等［36］在提取大豆油中DNA過程中，在用無水乙醇沉淀DNA時(shí)加入少量東北大豆黑衣33號(hào)DNA作為擔(dān)體，不僅能夠提高大豆油中DNA的得率，而且不會(huì)影響轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的結(jié)果，從而為轉(zhuǎn)基因深加工產(chǎn)品檢測(cè)過程中的DNA提取提供了新的手段。覃文等［8］在用異丙醇沉淀油脂DNA之前加入植物基因組DNA作為擔(dān)體，效果良好。白立群［37］在大豆油中DNA富集過程中，比較了線性丙烯酰胺和鮭魚精DNA作為擔(dān)體的效果，發(fā)現(xiàn)前者富集的DNA擴(kuò)增效率更高。Giménez等［13］在提取橄欖油中DNA過程中，也使用了線性丙烯酰胺作為擔(dān)體，且提取效果顯著。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然CTAB法、SDS法提取的DNA純度能夠滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般需要，但是還存在著一定的缺陷，如步驟繁雜，耗時(shí)長(zhǎng)，DNA損失較大，提取的DNA質(zhì)量不高等。另外，酚、三氯甲烷等有機(jī)溶劑有毒，有損操作者健康。磁珠法和離心柱方法多為一些商業(yè)試劑盒采用，它們均采用獨(dú)特的緩沖液體系，省去了酚/三氯甲烷抽提，減少了DNA的損失，操作簡(jiǎn)單而高效，提取的DNA質(zhì)量較高，但成本較高，提取量少。濃縮法和乳化法由于其提取步驟簡(jiǎn)單，DNA損失較少，而且能極大的富集食用油中DNA。

國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)食用油中DNA提取各種方法的提取效果進(jìn)行了對(duì)比。欒鳳俠等［34］比較了CTAB法和離心柱法提取精煉大豆油中DNA的效果，結(jié)果表明離心柱法操作簡(jiǎn)單快速，提取的DNA質(zhì)量高，效果顯著優(yōu)于CTAB法。Andreas Zimmermann等［38］比較了CTAB法，SDS法及離心柱法等9種DNA提取方法在提取大豆深加工產(chǎn)品中的效果，并從DNA質(zhì)量和產(chǎn)量2個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。他們發(fā)現(xiàn)，離心柱法提取的DNA量相對(duì)低，但是卻具有質(zhì)量高、易進(jìn)行PCR擴(kuò)增等特點(diǎn);相比之下，CTAB、SDS等方法雖然提取的DNA產(chǎn)量較高，但往往導(dǎo)致DNA質(zhì)量較低，易含有PCR抑制劑。Angela Di Pinto等［39］也發(fā)現(xiàn)，試劑盒中采用的磁珠法和離心柱法與CTAB法和SDS法相比，含有相對(duì)較少的污染物和PCR抑制劑。

高質(zhì)量DNA的提取是決定分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素。食用油中DNA提取主要包括3個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié):(1)樣品的前處理;(2)裂解和分離;(3)DNA富集和純化，其中最重要的環(huán)節(jié)就是DNA的富集和純化。隨著科技的不斷發(fā)展，納米磁珠和生物膜等新型DNA吸附材料未來將會(huì)在食用油等深加工產(chǎn)品的DNA提取過程中發(fā)揮重大作用，并能極大的提高分子生物學(xué)中技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用范圍。與此同時(shí)，還應(yīng)當(dāng)提升DNA的后續(xù)檢測(cè)技術(shù)的水平，提高其檢測(cè)靈敏度。

除此之外，隨著未來新型油料作物的增加，各種類油的出現(xiàn)，以及食用油摻假、摻雜現(xiàn)象的增加，快速的、高通量結(jié)合自動(dòng)化系統(tǒng)的DNA提取方法的應(yīng)用將會(huì)極大地降低提取時(shí)間和成本。

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The Research Development of DNA Isolation in Edible Oil

Zhang Hai-liang1，2，Wu Ya-jun1，Chen Yin-ji2，Ju Xing-rong2，Chen Ying1
1(Institute of Food Safety，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123，China)2(College of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210003，China)

To verify the production cultivar and authenticity of edible oil using DNA－based molecular methods has become the hot research.however，the bottle neck of the research is DNA isolation.DNA isolation is one of the basic techniques of molecular biology，and extracting DNA with high quality is the key of edible oil research.In this paper，we described several commonly used methods of DNA isolation in edible oil and their research developments in three aspects:(1)sample preparation;(2)lysis and isolation;(3)enrichment and purification of DNA.

food safety，edible oil，DNA isolation

碩士研究生(陳穎教授為通訊作者)。

*科技部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2008ZX08012);中央級(jí)公益性科研院所公益性行業(yè)(質(zhì)檢)科研專項(xiàng)(2009JK033)

2010－09－04，改回日期:2010－09－09