裙帶菜酸性多糖的分離純化與鑒定*

錢垂文，張志東，王一飛

1(暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地，廣東 廣州，510632) 2(暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州，510632)

裙帶菜酸性多糖的分離純化與鑒定*

錢垂文1，張志東2，王一飛1

1(暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地，廣東 廣州，510632) 2(暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州，510632)

利用水煮法及乙醇分級沉淀獲得裙帶菜粗多糖(UPPS-2)，粗多糖經(jīng)DEAE離子交換層析獲得2個(gè)純化組分(UPPS-2.1、UPPS-2.2)。對UPPS-2.1、UPPS-2.2樣品進(jìn)行了系列的理化特性鑒定(包括分子質(zhì)量、糖含量、蛋白含量、硫酸基含量、葡萄糖醛酸含量、單糖組成及含量、糖苷鍵構(gòu)型等)。試驗(yàn)結(jié)果表明:UPPS-2.1、UPPS-2.2的相對分子質(zhì)量分別為1.5×105、9.4×104;糖含量分別為27.49%、31.06%;蛋白含量分別為0.00%、1.14%;硫酸基含量分別為16.90%、26.33%;二者的單糖組成相同(包括海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖)，但組成單糖的含量差異較大，前者以巖藻糖(85.78%為主，而后者主要以巖藻糖(35.93%)和甘露糖(55.76%)為主;紅外光譜測定結(jié)果表明，二者均具有多糖特征吸收峰，糖苷鍵構(gòu)型主要為β-糖苷鍵。經(jīng)純化后獲得多糖組分UPPS-2.1是以β-糖苷鍵連接的主要由巖藻聚糖為主的雜多糖硫酸酯，而UPPS-2.1則是以β-糖苷鍵連接的主要由巖藻糖和甘露糖組成的雜多糖硫酸酯。

裙帶菜，多糖，純化，鑒定

裙帶菜(Undaria pinnatifida(Harv.)Suringar)屬褐藻門裙帶菜屬，是一種溫帶性多年生大型褐藻，主要分布在日本、朝鮮半島和我國大連、青島沿海。我國產(chǎn)裙帶菜主要作為食材出口到日本，年產(chǎn)值約10億元。由于出口國單一，國內(nèi)消費(fèi)市場尚未形成，產(chǎn)品不能進(jìn)行深加工，附加值低，價(jià)格逐年下降。

裙帶菜營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“天然海洋蔬菜之首”，具有重要的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，同時(shí)在藥物研發(fā)方面也顯示出潛在的開發(fā)前景［1－3］。裙帶菜中含有多種營養(yǎng)成分，據(jù)初步分析100 g干品中含粗蛋白11.6 g，脂肪 0.32 g，糖類 37.81 g，灰分 18.93 g，還含有多種維生素，其中糖類是裙帶菜中重要組成成分。目前國內(nèi)外對裙帶菜多糖的提取工藝研究報(bào)道較多，由于多糖成分、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對其理化性質(zhì)深入研究的很少。本文利用現(xiàn)代先進(jìn)儀器設(shè)備及經(jīng)典檢測方法對裙帶菜多糖的理化性質(zhì)作了一個(gè)較為全面的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

新鮮裙帶菜，產(chǎn)自大連海域(5月份)。

DEAE-Cellulose 52離子交換樹脂(Whatman公司進(jìn)口分裝)，標(biāo)準(zhǔn)單糖、苯酚、三氟乙酸、咔唑、硫酸銅、酒石酸鈉等試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裙帶菜多糖的分離純化［4］

1.2.1.1 裙帶菜多糖的初步純化

用自來水將裙帶菜洗凈→蒸餾水洗2次→50℃烘干→粉碎→加熱浸提(攪拌)→離心取清液→加熱濃縮(原體積的1/8)→乙醇沉淀(含醇量達(dá)75%)→4℃靜置12 h→離心取沉淀→50℃干燥→粗多糖干品(UPPS-0)→將粗多糖加水復(fù)溶→加入乙醇至醇含量達(dá)20%→4℃靜置12 h→離心→沉淀依次用丙酮、乙醚、無水乙醇洗滌，50℃干燥得褐藻膠(UPPS-1)→上清繼續(xù)加入乙醇至醇含量達(dá)60%→4℃靜置12 h→離心→沉淀依次用丙酮、乙醚、無水乙醇洗滌，50℃干燥得裙帶菜多糖初品(UPPS-2)

1.2.1.2 裙帶菜多糖的精純(DEAE離子交換層析)

裝柱:將活化后的DEAE-cellulose 52離子交換填料裝填柱型為26cm×20cm層析柱(柱床高度為15cm)。

平衡:用20mmol/L的 Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床3個(gè)柱床體積。

上樣:稱取UPPS-2(多糖初品)100 mg用15mL 20mmol/L的Tris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上樣。

洗脫:依次用 20mmol/L的 Tris-HCl液及用20mmol/L 的 Tris-HCl溶液配成的含 0.1、0.3、0.5、1.0mol/L NaCl溶液洗脫。

收集:用Waters自動收集儀收集，每管10mL，每組收30管。收集液用苯酚-硫酸顯色法跟蹤檢測多糖，在波長為490nm處測定吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內(nèi)的洗脫液合并，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，蒸餾水透析2天，冷凍干燥，得到裙帶菜多糖的精純產(chǎn)物。

1.2.2 裙帶菜多糖的鑒定

1.2.2.1 多糖相對分子量的測定［5］

1.2.2.2 多糖樣品中總糖含量測定［6］

1.2.2.3 多糖的樣品中蛋白質(zhì)含量的測定(Lowry法)［7］

選用核酸蛋白測定儀(美國Beckman公司)。

1.2.2.4 多糖紫外光譜分析［8］

所用紫外分光光度計(jì)為日本島津公司UV-1700型。

1.2.2.5 多糖樣品中總硫酸基含量的測定［9］

1.2.2.6 多糖樣品中葡萄糖醛酸含量的測定——硫酸-咔唑法［10］

1.2.2.7 裙帶菜多糖的單糖組成

(1)利用高效離子色譜分析單糖組分［11－12］。離子色譜儀(美國戴安公司TCS-2500型)，色譜條件:分離柱采用Dionex公司Carbo PacTMPA10預(yù)處理柱、Carbo PacTMPA10(2.0 mm×250 mm)檢測柱;脈沖安培檢測器工作參數(shù):E1為100 mV，400 ms;E2為－2 000 mV，20 ms;E3為600 mV，10 ms;E4為－100 mV，70 ms。流動相:采用濃度為20 mmol/L的NaOH作淋洗液;淋洗方法采用單一濃度淋洗。流速:0.25mL/min;上樣量:25μL;溫度 30℃。

(2)薄層色譜(TLC)分析［13］。

1.2.2.8 裙帶菜多糖的結(jié)構(gòu)分析

(1)紅外光譜測定多糖的糖苷鍵構(gòu)型［14］。取裙帶菜多糖樣品各2 mg，與100～200 mg KBr混合于瑪瑙研缽中研細(xì)，壓片，在紅外光譜儀(德國BRUKER EQUINOX55型)上作全波段(4 000～400cm－1)掃描。

(2)比旋光度法［15］。分別稱取多糖各10 mg，蒸餾水溶解并定容至25mL，T=20℃，以數(shù)顯自動旋光儀型(上海WZZ-2A型)測定多糖旋光度，以蒸餾水為空白。

2 結(jié)果與討論

2.1 裙帶菜多糖的純化結(jié)果

裙帶菜多糖UPPS-2經(jīng)DEAE-Cellulose52離子交換柱層析，洗脫曲線如圖1。

圖1 多糖UPPS-2在DEAE-52層析柱上的洗脫曲線

通過苯酚-硫酸法檢測顯示在第76、102管(即380、510 min)分別出現(xiàn)吸收峰值，對應(yīng)洗脫條件為0.3、0.5mol/L NaCl溶液。分別合并72～82管，99～107管，得到UPPS-2.1、UPPS-2.2兩個(gè)組分，經(jīng)凍干后，UPPS-2.1為白色纖維狀，質(zhì)量43.7 mg;UPPS-2.2為淺黃色纖維狀，質(zhì)量9.8 mg，離子交換層析的產(chǎn)率分別為43.7%及9.8%。

2.2 裙帶菜多糖的鑒定結(jié)果

2.2.1 裙帶菜多糖的理性特性

UPPS-2及UPPS-2.1、UPPS-2.2純化組分的部分理化特性多糖結(jié)果見表1。

表1 裙帶菜多糖鑒定(部分)結(jié)果

2.2.2 多糖的紫外吸收光譜圖

由圖2～圖4可見，3種多糖的紫外吸收圖譜與Lowry法所測蛋白質(zhì)含量的結(jié)果一致。

2.2.3 裙帶菜多糖的單糖組成

2.2.3.1 離子色譜分析

保留時(shí)間(min):1，海藻糖(Fuc)4.87;2，鼠李糖(Rha)8.08;3，阿拉伯糖(Ara)9.08;4，半乳糖(Gal)11.40;5，葡萄糖(Glu)12.52;6，甘露糖(Man)/木糖(Xyl)14.30。

圖2 UPPS-2的紫外光譜圖

圖3 UPPS-2.1的紫外光譜圖

圖4 UPPS-2.2的紫外光譜圖

圖5 各標(biāo)準(zhǔn)單糖的離子色譜圖

圖6 UPPS-2.1的離子色譜圖

圖7 UPPS-2.2的離子色譜圖

將裙帶菜多糖UPPS-2.1/UPPS-2.2的單糖組成高效粒子色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效離子色譜圖進(jìn)行比對確定其單糖組成，同時(shí)對各峰面積進(jìn)行定量計(jì)算確定各單糖組成的相對含量，結(jié)果見表2。

表2 純化樣品 UPPS-2.1、UPPS-2.2中單糖的組成及相對百分比

2.2.3.2 薄層色譜(TLC)分析

對UPPS-2.1和UPPS-2.2進(jìn)行薄層層析分析其單糖組成，結(jié)果如圖8所示。

根據(jù)UPPS-2.1和UPPS-2.2的Rf值推斷其單糖組成結(jié)果與離子色譜結(jié)果基本一致，唯一不同的是2種多糖均檢出葡萄糖醛酸，而在離子色譜中未檢出，推測可能因?yàn)槠咸烟侨┧岬南疵摃r(shí)間太短，離子色譜未能檢出。

2.2.4 裙帶菜多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.2.4.1 紅外光譜測定多糖的糖苷鍵構(gòu)型［16－17］

UPPS-2.1、UPPS-2.2紅外吸收光譜經(jīng)查標(biāo)準(zhǔn)圖譜［19］得各多糖紅外光譜解析結(jié)果，具體結(jié)果見表3。

圖8 UPPS-2.1、UPPS-2.2的薄層色譜圖

表3 UPPS-2.1、UPPS-2.2紅外吸收光譜解析

由表3中可以看出，UPPS-2.1、UPPS-2.2均含有多糖的特征吸收峰，其中3 600～3 200cm－1和1 400～1 200cm－1的2組特征吸收峰是判斷多糖的依據(jù);810cm－1附近為甘露糖的特征吸收峰，它的位置與硫酸根在糖上的連接位置有關(guān)，吸收峰位于817.76cm－1及 817.67cm－1說明 UPPS-2.1、UPPS-2.2 的硫酸根連接在巖藻糖的 C2或 C3位;UPPS-2.2在1 243.53cm－1處有較強(qiáng)的吸收峰，表明其硫酸基含量較高。綜合上述結(jié)果，可見二種多糖均為巖藻甘露吡喃聚糖，主要由β-糖苷鍵組成。

2.2.4.2 比旋光度法

裙帶菜多糖UPPS-2.1的比旋光度［α］為－75，UPPS-2.2的比旋光度［α］為－37.5。由于UPPS-2.1與UPPS-2.2的比旋光度都為較大的負(fù)值，可以判定它們都是主要以β-糖苷鍵連接的，這與紅外光譜測定的結(jié)果相一致。

由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性(特別是空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性)，限于目前的研究手段和方法，還無法對其結(jié)構(gòu)做出精確的解析。本課題的研究，為裙帶菜多糖的綜合開發(fā)打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

經(jīng)分離純化獲得兩種多糖中，UPPS-2.1產(chǎn)率較高，相對分子質(zhì)量為1.5×105，經(jīng)組成與結(jié)構(gòu)分析，確定其是以β-糖苷鍵連接的主要由巖藻聚糖為主的雜多糖硫酸酯;而UPPS-2.2產(chǎn)率相對較低(9.8%)，相對分子量為9.4×104，組成與結(jié)構(gòu)和UPPS-2.1基本相同，是主要由巖藻糖和甘露糖組成的雜多糖硫酸酯，多糖的硫酸基連接在巖藻糖的C2或C3位上。

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Purification and Identification of Acid Polysaccharide from Undaria pinnatifida

Qian Chui-wen1，Zhang Zhi-dong2，Wang Yi-fei1
1(Jinan Biomedicine Research and Development Center，Jinan University，Guangzhou 510632，China)2(The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

To isolate and identify the acid polysaccharides from Undraria pinnatifida.Methods:Crude polysaccharides were extracted by alcohol grade precipitation from boiled Undraria pinnatifida solvent，then the crude polysaccharides were seperated by DEAE-Cellulose 52 chromatography.Two fractions obtained after elution were named UPPS-2.1 and UPPS-2.2.The physicochemical properties of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 were studied including molecular weight，percentage of total sugar，protein，sulfate，and composition of monosaccharides，patterns of glucosidic bond.Results:The molecular weight of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 was 1.5 ×105，9.4 ×104respectively，the percentage of total sugar was 27.49%，31.06%，the percentage of protein was 0.00%，1.14%，the percentage of sulfate wa 16.90%，26.33%in UPPS-2.1 and UPPS-2.2 respectively.Monosaccharide composition of UPPS-2.1 and UPPS-2.2 was same，but the percentage of monosaccharides was different by ion chromatography.The purified polysaccharides is mainly composed of β-glucosidic bonds.The main monosackcharide of the UPPS-2.1 was Fuc(85.78%)，whereas in UPPS-2.2 were Fuc(35.93%)and Man/Xyl(55.76%).The SO42－of polysaccharides is link up with C2 or C3 in Fuc.Conclusion:The UPPS-2.1 was mainly composed of Fuc sulfate heterosaccharides linked by β-glucosidic bond.Whereas the UPPS-2.2 was mainly composed of Fuc and Man/Xyl sulfate heterosaccharides linked by β-glucosidic bond.

Undaria pinnatifida，polysaccharide，purification，identification

博士研究生，助理研究員(王一飛教授為通訊作者E-mail:twangyf@jnu.edu.cn)。

*國家自然科學(xué)基金廣東聯(lián)合基金(U0632010);廣州市天河區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(072G111)基金資助

2010－03－10，改回日期:2010－10－28