飼料中霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

鄧惠中 賀建華

霉菌毒素普遍存在于飼料以及飼料原料中，據(jù)美國(guó)食品和藥物管理局的調(diào)查表明全球25%的飼料及飼料原料受到霉菌毒素的污染。飼料中霉菌毒素影響動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能，如動(dòng)物對(duì)霉變飼料中養(yǎng)分的利用率顯著下降；因采食霉變飼料而誘發(fā)的多種動(dòng)物疾?。挥绊戯暳线m口性；產(chǎn)毒霉菌和致病細(xì)菌等存在的幾率大大提升[1-2]。飼料中霉菌毒素對(duì)動(dòng)物的影響通過(guò)食物鏈傳遞到食品安全[3]，同時(shí)對(duì)人類(lèi)健康也產(chǎn)生了威脅，所以必須對(duì)飼料及原料中霉菌毒素水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。本文對(duì)飼料中霉菌毒素常規(guī)檢測(cè)技術(shù)作了簡(jiǎn)要綜述，并總結(jié)了霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)近十年的發(fā)展，為霉菌毒素的檢測(cè)工作提供科學(xué)參考。

1 霉菌毒素檢測(cè)的樣品處理

在霉菌毒素檢測(cè)的取樣、制樣和分析中都客觀的存在一定誤差。由于真菌毒素的污染是極不均勻的，在農(nóng)產(chǎn)品中的存在“10-9”水平，所以取樣環(huán)節(jié)產(chǎn)生的誤差最大，約占總誤差的85%以上，而制樣與分析兩個(gè)環(huán)節(jié)共占總誤差的15%以下[4]。采樣要注意代表性并防止污染，準(zhǔn)備滅菌容器和工具，詳細(xì)記錄樣品相關(guān)信息，低溫干燥保存，及時(shí)檢測(cè)[5]。原始樣品必須粉碎后進(jìn)行二次取樣，粉碎粒度越小，樣品均勻度越好。如果樣品粉碎粒度不佳，可以將粉碎樣品放入攪拌機(jī)中加入適量溶劑（水或庚烷）攪拌成泥漿狀[6]。霉菌毒素的提取常用的提取溶劑，如：甲醇、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈和水的混合物[7]。定性分析還需對(duì)提取液中的霉菌毒素進(jìn)行分離。

2 常規(guī)霉菌毒素分析測(cè)定技術(shù)

霉菌毒素的分析測(cè)定不僅要考慮精確度，還要考慮分析的速度、成本以及分析能否提供定性或者定量的結(jié)果。分析測(cè)定應(yīng)該根據(jù)分析目的以及實(shí)際情況選取快速、簡(jiǎn)單和定量的方法。

2.1 薄層色譜測(cè)定法(Thin Layer Chromatography,TLC)

薄層色譜測(cè)定法(TLC)是最早建立的一種檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、對(duì)設(shè)備和檢驗(yàn)人員要求不高等特點(diǎn)。此法的原理是針對(duì)不同的樣品，使用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來(lái),經(jīng)柱層析凈化,再在薄層板上層析展開(kāi)、分離,利用霉菌毒素的熒光性,根據(jù)熒光斑點(diǎn)的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定其最低含量。大麥和咖啡豆中赭曲霉毒素A的TLC檢測(cè)方法分別在1973年和1975年首次通過(guò),成為國(guó)際分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(Association of Analytical Communities,AOAC)的官方方法，1988年成為法定方法[8]。1991年，我國(guó)衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所等單位建立了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的TLC分析方法?，F(xiàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法仍采用此法檢測(cè)小麥、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的含量，檢測(cè)下限為 10 μg/kg[9]。

2.2 高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)

高效液相色譜方法(HPLC)在20世紀(jì)60年代開(kāi)始使用，近幾年來(lái)在各個(gè)行業(yè)的發(fā)展迅速。HPLC法是定量分析真菌毒素的常規(guī)方法，其原理是在適宜的流動(dòng)相條件下，采用固相萃取柱，使多種霉菌毒素同時(shí)分離進(jìn)行檢測(cè)后再通過(guò)測(cè)量色譜峰的面積計(jì)算含量。該方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，可同時(shí)分離多種霉菌毒素，操作也簡(jiǎn)便，適于大批量樣品的分析。據(jù)報(bào)道用HPLC法檢測(cè)食品中黃曲霉毒素，分離效果好，重復(fù)性強(qiáng)，最低檢出限達(dá)到10-12級(jí)水平，回收率在92.61%～99.25%[10]。檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素，檢測(cè)限分別為0.24、4.0和0.5 mg/kg[11]。但此方法的儀器價(jià)格昂貴，前處理繁瑣，方法的建立復(fù)雜，操作的技術(shù)難度大，短時(shí)間內(nèi)難以廣泛應(yīng)用。

2.3 氣相色譜法(Gas Chromatography GC)

1986年AOAC就將氣相色譜法(GC)引入到小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的檢測(cè)方法中,檢測(cè)限為350 ng/g?，F(xiàn)氣相色譜法主要用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的定量檢測(cè)。GC具有靈敏、高選擇性、準(zhǔn)確性和精確性等優(yōu)點(diǎn)。但也存在如下問(wèn)題：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系不佳、樣品進(jìn)樣的滯留、記憶效應(yīng)以及基質(zhì)干擾的存在[12]。GC不及液相色譜法快速,檢測(cè)費(fèi)昂貴,技術(shù)和操作要求也高,所以在霉菌毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用較少。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）20世紀(jì)70年代初提出，80年代引入國(guó)內(nèi)應(yīng)用于各種生物化學(xué)物質(zhì)的免疫測(cè)定，是檢驗(yàn)乙肝、丙肝、艾滋病抗體的主要方法。此法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，能進(jìn)行定量分析，特異性強(qiáng)，試劑保存時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境污染小，目前已經(jīng)拓展到食品、飼料、肉類(lèi)等行業(yè)。多個(gè)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中霉菌毒素的檢測(cè)方法中都包含此方法，如糧食、發(fā)酵酒、發(fā)酵性豆制品、淀粉類(lèi)制品、花生油和其他食用植物油、色拉油、醬油、醬、食醋、嬰幼兒配方乳粉Ⅱ、Ⅲ[13-22]等。現(xiàn)在建立在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法基礎(chǔ)上研發(fā)的商業(yè)化的試劑盒能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量樣品的分析，檢測(cè)成本相對(duì)較低，檢測(cè)限達(dá)1 ng/kg，能符合歐盟的檢測(cè)要求。但酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法存在假陽(yáng)性的情況，需要進(jìn)一步的研究來(lái)完善此方法。

3 霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

隨著分析檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展以及生物技術(shù)的引入使得霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，一些新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)踐之中。

3.1 時(shí)間分辨熒光免疫分析 (Time Resolved Fluoroimmunoassay TRFIA)

時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)屬于超微量檢測(cè)領(lǐng)域中一項(xiàng)新興的檢測(cè)技術(shù)，由Pettersson等人于上世紀(jì)八十年代創(chuàng)立。原理是以熒光強(qiáng)度高且衰變時(shí)間長(zhǎng)的三價(jià)稀土離子為標(biāo)志物來(lái)延緩測(cè)量時(shí)間，等樣品中短壽命的自然熒光衰變后再測(cè)稀土離子的熒光，可消除自然熒光的干擾。據(jù)報(bào)道黃曲霉毒素B1的高靈敏時(shí)間分辨熒光免疫分析法的靈敏度為0.01 μg/l，檢測(cè)范圍0.01～100 μg/l,批內(nèi)和批間變異分別為4.1%和6.8%，平均回收率為97.2%[23]。TRFIA的熒光計(jì)數(shù)可以跨越4個(gè)數(shù)量級(jí),可測(cè)范圍可以達(dá)到0.01～100 μg/l，既可以滿(mǎn)足低濃度的限量要求，也可以滿(mǎn)足較寬范圍的定量檢測(cè)要求，是一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的可進(jìn)行大批量樣品篩查的方法[24]。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是近年來(lái)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的技術(shù)。PCR技術(shù)的基本原理是應(yīng)用細(xì)菌遺傳物質(zhì)中各菌屬菌種高度保守的核酸序列，設(shè)計(jì)出相關(guān)引物，對(duì)提取到的細(xì)菌核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而用凝膠電泳和紫外核酸檢測(cè)儀觀察擴(kuò)增結(jié)果[25]。劉秀梅以伏馬毒素合成酶基因?yàn)榛A(chǔ)，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物,建立了伏馬菌素產(chǎn)毒菌株P(guān)CR鑒定技術(shù),32株分離菌株的伏馬菌產(chǎn)毒基因測(cè)定結(jié)果與生物合成毒素的HPLC測(cè)定結(jié)果符合率良好，同時(shí)明確了產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株在核苷酸序列上的差異[26]。據(jù)報(bào)道，有研究者通過(guò)PCR法檢測(cè)棒曲霉毒素合成簇上的一個(gè)關(guān)鍵的脫青霉基因作為毒素是否產(chǎn)生的指標(biāo)，經(jīng)過(guò)HPLC法驗(yàn)證后表明，其與HPLC法的相關(guān)性良好[27]。此法簡(jiǎn)便快速，但并不完善。需要對(duì)毒素合成機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)分析,檢測(cè)體系也需要實(shí)踐驗(yàn)證,比如有些黃曲霉菌株含有黃曲霉毒素合成基因,但并不產(chǎn)生毒素[28]。

3.3 生物傳感器(Biosensor)

1967年S.J.烏普迪克等研制出第一個(gè)生物傳感器（葡萄糖傳感器）。生物傳感器是將生物技術(shù)和電子技術(shù)相結(jié)合的，以生物學(xué)組件作為主要功能性元件，能夠感受一定范圍內(nèi)的被測(cè)量，并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可識(shí)別信號(hào)的器件或裝置，包括利用酶的特性的催化型生物傳感器(酶?jìng)鞲衅骱臀⑸飩鞲衅鞯?和利用分子間特異的親和性的親和型生物傳感器(免疫傳感器和DNA傳感器等)。生物傳感器是開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)霉菌毒素的有效技術(shù)，通過(guò)光纖免疫傳感器來(lái)測(cè)定花生和玉米抽提物中的黃曲霉毒素B1，檢測(cè)限可達(dá)0.05 ng/ml[29]。一些研究初步探索了酶生物傳感器三電極系統(tǒng)對(duì)雜色曲霉素(ST)的電化學(xué)分析[30]，檢測(cè)下限為 8.32×10-5mg/ml，響應(yīng)時(shí)間 10 s。Arduini F 研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2和 M1)可以抑制乙酰膽堿質(zhì)酶的活性。根據(jù)這一特性，在設(shè)定乙酰膽堿質(zhì)酶的濃度、反應(yīng)時(shí)間的前提下，乙酰膽堿質(zhì)酶的活性下降和黃曲霉毒素的濃度(10～60 ng/ml)成正比，并且該操作在3 min之內(nèi)就可完成，該方法進(jìn)一步完善后能應(yīng)用于黃曲霉毒素的檢測(cè)[31]。

4 霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)未來(lái)發(fā)展方向

霉菌毒素快速檢測(cè)方法的研發(fā)，要求在30 min內(nèi)（包含樣品制備的時(shí)間在內(nèi)）或5 min內(nèi)（不包含樣品制備的時(shí)間）完成快速檢測(cè)。金標(biāo)試紙法在進(jìn)行測(cè)定樣品時(shí)無(wú)需大型檢測(cè)儀器和加入任何試劑，不需接觸標(biāo)準(zhǔn)品，方法簡(jiǎn)便快捷，15 min內(nèi)即可得到結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了一步法檢測(cè)[32]。應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的方法,研制了快速檢測(cè)赭曲霉毒素A的膠體金試紙條,檢測(cè)限為 10 ng/ml，有效檢測(cè)范圍 0～100000 ng/ml，檢測(cè)時(shí)間10 min[33]。2009年6月，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料所信息中心主辦的“首屆飼料企業(yè)霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)暨飼料防霉應(yīng)用技術(shù)培訓(xùn)班”大力推廣介紹了霉菌毒素金標(biāo)試紙法快速檢測(cè)方法。在質(zhì)量保證和風(fēng)險(xiǎn)管理的層次，需要做到在關(guān)鍵點(diǎn)監(jiān)測(cè)污染的食物鏈；查明和監(jiān)測(cè)故障的產(chǎn)品和“隱蔽”毒素，改善和發(fā)展定性檢測(cè)。利用分子檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)全球的赭曲霉毒素A和黃曲霉產(chǎn)物種類(lèi)以避免貿(mào)易壁壘的產(chǎn)生。利用基因組學(xué)開(kāi)發(fā)特殊的標(biāo)記基因來(lái)檢測(cè)特殊的產(chǎn)毒真菌種群，為霉菌毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)測(cè)新產(chǎn)毒真菌種群提供有效的科學(xué)基礎(chǔ)。

5 小結(jié)

飼料中霉菌毒素檢測(cè)與人類(lèi)以及動(dòng)物的健康和生產(chǎn)密切相關(guān)，因此研發(fā)有效、低成本、快速的檢測(cè)手段尤為重要。霉菌毒素的檢測(cè)應(yīng)該發(fā)展為綠色檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)大多要以霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，而霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品的毒性非常強(qiáng)，這樣對(duì)檢測(cè)的安全帶來(lái)了很大隱患。檢測(cè)過(guò)程中的提純和分離需要用到大量的極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑，這些溶劑對(duì)環(huán)境污染很大，必須進(jìn)行回收。今后霉菌毒素檢測(cè)研究的重點(diǎn)方面在于實(shí)驗(yàn)室工作人員無(wú)害的分析方法；各種產(chǎn)品和真菌毒素包括采樣計(jì)劃在內(nèi)的分析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立；高靈敏、高特異性、綠色、節(jié)能、快速和便捷的檢測(cè)方法及檢測(cè)儀器的開(kāi)發(fā)。

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[16]GB/2713—81淀粉類(lèi)制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).

[17]GB/2716—81食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).

[18]GB/13103—91色拉油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).

[19]GB/2717—81醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).

[20]GB/2718—81醬衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).

[21]GB/2719—81食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).

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