實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR方法檢測(cè)飼料中雞源性成分

劉彥泓 穆 春 孫 屏 楊 滴 劉岑杰 夏元鳳 徐建平

瘋牛病、禽流感等大規(guī)模傳染性疾病的肆虐和蔓延,給全世界帶來(lái)了巨大的災(zāi)難。流行病學(xué)證明瘋牛病、羊癢病和人的克雅氏病、庫(kù)魯病都是由該變性蛋白質(zhì)通過(guò)食物鏈傳播而引起的,因此,動(dòng)物源性飼料的大規(guī)模應(yīng)用,存在很多不安全的因素。為了徹底切斷瘋牛病的傳播途徑,2000年歐盟禁止生產(chǎn)和使用動(dòng)物源性飼料,隨后世界上很多國(guó)家都將飼料中含有動(dòng)物源性成分列為主要檢疫范圍,包括牛、羊源性，禽源性成分等動(dòng)物源性成分,嚴(yán)禁含有禽源性等成分的飼料進(jìn)口[1]。作為農(nóng)業(yè)大國(guó),我國(guó)必須加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源性飼料的監(jiān)管,嚴(yán)格檢驗(yàn)檢疫銷(xiāo)售和使用的飼料。因此,急需建立能夠快速、準(zhǔn)確鑒別檢測(cè)飼料中雞源性成分的方法。本研究采用常規(guī)PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)飼料中雞源性成分,方法的靈敏度高,實(shí)用性強(qiáng),適用于雞源性成分的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

生雞肉購(gòu)自大連市場(chǎng)。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒：Promega公司的Magnetic DNA Purification System For Food試劑盒。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑盒(Premix Ex TaqTM)、10×PCR緩沖液/dNTP溶液、ExTaqDNA聚合酶、100 bp Maker(片段大小分別為100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 500 bp)均購(gòu)自TaKaRa大連寶生物公司。

1.3 儀器

低溫高速離心機(jī)（Eppendorf）、恒溫水浴箱、實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀（ABI7000）、PCR 儀（ABI2700）、生物安全柜（蘇凈安泰）。

1.4 引物及探針序列

引物合成及探針合成、標(biāo)記購(gòu)自TaKaRa大連寶生物公司，實(shí)時(shí)熒光PCR引物序列及探針的序列見(jiàn)表1；常規(guī)PCR引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表2。

1.5 模板DNA的提取

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

采用Promega公司的Magnetic DNA Purification System For Food試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光 PCR擴(kuò)增反應(yīng)具體條件：95℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，40 個(gè)循環(huán)。

表3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.7 常規(guī)PCR檢測(cè)

PCR 反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液 2 μl；dNTP（各 2.5 mmol/l）2 μl;上下游引物(10 000 nM)各 1 μl；ExTaqDNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl；DNA 模板(200～500 ng)2 μl;ddH2O加至25 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃變性3 min;94℃ 60 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)：制備2%的瓊脂糖凝膠，取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μl與 1 μl（6×）加樣緩沖液混勻，用1×TAE電泳液進(jìn)行凝膠電泳分析，用100 bp Ladder DNA Marker作分子量標(biāo)記，攝影并記錄。

1.8 特異性檢測(cè)

采用提取的牛、羊、豬、馬、狗、魚(yú)、大豆、玉米的DNA作為對(duì)照，與提取的雞肉的基因組DNA同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增。

1.9 靈敏度檢測(cè)

將雞肉粉混入豬肉粉，使其含量達(dá)到1%，對(duì)于含量在1%以下的樣品，將提取的1%含量的雞DNA溶液進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋?zhuān)蛊浜窟_(dá)到相當(dāng)于實(shí)際樣品雞肉粉含量的 0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增。

1.1 0 飼料樣品的檢測(cè)

選取寵物食品、雞血飼料、雞骨粉、雞羽毛粉，提取其DNA，與提取的雞肉的基因組DNA同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果及分析

2.1 特異性檢測(cè)結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)幾種動(dòng)植物的DNA擴(kuò)增，結(jié)果只有雞被檢測(cè)出，形成擴(kuò)增曲線，其他則沒(méi)有特異性擴(kuò)增曲線，表明本研究所選取的DNA片段特異性比較強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果也顯示同樣的特異性。

2.2 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)不同含量的雞基因組DNA模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到實(shí)時(shí)熒光PCR的檢出限為0.001%，結(jié)果如圖2所示。本研究的檢出限比金凌艷等[2]實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)牛羊源性成分的方法檢出限低，這可能與基因組DNA的提取質(zhì)量有關(guān)。

對(duì)于常規(guī)PCR，當(dāng)含量達(dá)到0.1%時(shí)，電泳條帶較暗，含量達(dá)到0.01%時(shí)沒(méi)有條帶，如圖3所示（第2、3、4泳道）。說(shuō)明常規(guī)PCR能夠檢出的最低含量為0.1%，這與潘良文、張舒亞等[3-4]的研究結(jié)論相同。

圖3 常規(guī)PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.3 檢測(cè)飼料樣品的結(jié)果

對(duì)不同飼料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖4、圖5所示。說(shuō)明幾種飼料中含有雞源性成分，一種寵物食品中不含有雞源性成分。

3 討論

本研究選擇雞線粒體DNA作為對(duì)象，根據(jù)Genbank中提供的基因序列，設(shè)計(jì)并優(yōu)化了針對(duì)雞的特異性引物及探針。線粒體DNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，基因組中無(wú)間隔系列，無(wú)組織特異性，種內(nèi)遺傳穩(wěn)定，種間高度變異，個(gè)體中不同組織線粒體DNA高度均一[5-6]，可以獲得較高的拷貝數(shù)，易于檢測(cè)。目前，線粒體DNA序列已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究物種的遺傳分化、群體遺傳結(jié)構(gòu)、物種進(jìn)化、飼料成分監(jiān)督等[7-8]。

在飼料加工過(guò)程中，原料通常需要經(jīng)過(guò)高溫干燥、油炸、粉碎等高強(qiáng)度處理，會(huì)造成DNA分子的斷裂及損失，在一定程度上增加了PCR檢測(cè)的難度。本研究設(shè)計(jì)的常規(guī)PCR檢測(cè)目的片段長(zhǎng)度為161 bp，既可以滿足實(shí)驗(yàn)需要，又保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相當(dāng)于定性PCR與分子雜交的結(jié)合，它能區(qū)別只有少數(shù)堿基差異的DNA序列，具有高特異性和高精確性的優(yōu)點(diǎn)[9]。而且實(shí)時(shí)熒光PCR是在封閉的體系中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束無(wú)需進(jìn)行電泳，避免污染和危害，縮短了檢測(cè)時(shí)間。通過(guò)對(duì)市售飼料樣品和送檢骨粉樣品的檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10份飼料有4種檢出含有雞源性成分，6份油炸骨粉中1種標(biāo)明豬骨粉中檢出雞源性成分，進(jìn)一步證明本研究所建立的常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可靠性，可以作為雞源性成分的常規(guī)檢驗(yàn)方法。

[1]潘良文，陳家華.食品和飼料中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法的進(jìn)展[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2002(2):45-47.

[2]金凌艷，顧欣，蔡金華,等.應(yīng)用兩種PCR方法檢測(cè)飼料中牛、羊源性成分[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2008(10):76-80.

[3]潘良文，陳家華，丁燕,等.進(jìn)口肉骨粉中牛成分檢測(cè)研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2001(5):23-26.

[4]張舒亞，管薇薇，劉月明,等.飼料中魚(yú)源性真實(shí)性鑒別研究[J].飼料研究,2009(6):45-46,48.

[5]Anderson S,Bankier B G,Bruijn M H,et al.Sequence and organization of the human mitochondrial genome[J].Nature,1981(290):457-465.

[6]雷初,陳宏,王德,等.關(guān)于驢線粒體DNA D-Loop多態(tài)性分析[J].中國(guó)畜牧雜志,2004(4):10-12.

[7]Wolstenholme D R.Animal mitochondrial DNA:structure and evolution[J].Int.Rev.Cytol.,1992(141):173-216.

[8]Tartaglia M,Saulle E,Pestalozza S,et al Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds:a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials[J].Journal of Food Protection,1998,61(5):513-518.

[9]Heid C A,Stevens J,Livak K J,et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Research,1996(6):986-994.