宮頸病變與端粒酶及端粒酶基因*

黃相艷,石 紅

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連 116011)

宮頸癌是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，HPV感染雖是其已知的主要致病因素，但由于HPV并不能單獨(dú)致瘤，細(xì)胞內(nèi)遺傳性因素的改變可能具有更重要的意義?，F(xiàn)代遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究均提示在宮頸上皮病變中存在人類染色體端粒酶基因(the human telomerase gene，hTERC)的擴(kuò)增，鑒于已知端粒酶在腫瘤發(fā)生中的重要作用及其與端粒酶基因表達(dá)的一致性，人們推測(cè)，染色體端粒酶基因的擴(kuò)增與宮頸病變的發(fā)生有密切聯(lián)系。本文就相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述。

1 染色體異常與宮頸癌變

分子生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，腫瘤是基因病。各種環(huán)境的和遺傳的致癌因素可能以協(xié)同或序貫的方式引起細(xì)胞內(nèi)非致死性的DNA損害，這種錯(cuò)誤的不斷積累導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。宮頸癌也是多種遺傳事件不斷積累的結(jié)果，只是不同腫瘤具有不同的異常染色體及染色體帶，每種類型腫瘤的染色體改變具有特異性及一致性。子宮頸從不典型病變到浸潤(rùn)性癌常需要一段時(shí)間較長(zhǎng)、階段性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化期，其階段性進(jìn)程特性更有利于人們從細(xì)胞自身遺傳學(xué)角度研究其從CIN進(jìn)展為宮頸癌的機(jī)制，為從染色體分子水平研究宮頸病變提供了可能。

針對(duì)宮頸癌染色體異常的研究發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌變與1，3，4，5，6，11，13，17，18和20號(hào)染色體異常有關(guān)[2-4]。其中比較重要的是1號(hào)染色體和3號(hào)染色體，它們是主要的非隨機(jī)事件。關(guān)于3號(hào)染色體，國(guó)外已有研究[5-7]，3號(hào)染色體長(zhǎng)臂的擴(kuò)增可能是浸潤(rùn)性宮頸癌的重要特點(diǎn)和宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的早期事件。國(guó)內(nèi)劉騰飛等[8]在建立子宮頸癌發(fā)展演進(jìn)樹模型的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增(+3q)在子宮頸癌非隨機(jī)染色體事件統(tǒng)計(jì)中的發(fā)生頻率可高達(dá)70.7%，且+3q的出現(xiàn)可能導(dǎo)致+17q的發(fā)生，而+17q的發(fā)生又將促進(jìn)+20q的發(fā)生，+20q的發(fā)生必將增加+5p、+20p出現(xiàn)的概率。從距離樹可以清楚地得出+3q是宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中較重要的早期事件。國(guó)內(nèi)外這些針對(duì)子宮頸癌染色體的研究，均顯示了3號(hào)染色體長(zhǎng)臂的擴(kuò)增可能是宮頸癌變發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要事件和早期事件。這提示，在3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上可能存在與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腫瘤基因。此基因放大區(qū)域已經(jīng)被確定為3q24-28。其中，所涉及最重要的基因可能是人類染色體端粒酶基因[5-7](即hTERC基因，位于3q26.13)，這為后續(xù)相關(guān)研究指明了方向。

2 HPV與端粒酶及端粒酶基因

目前的研究已經(jīng)表明,高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是宮頸癌發(fā)病的首要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)80%的婦女一生中都會(huì)有過(guò)一次HPV感染，但由于人體自身具有免疫力，多數(shù)HPV會(huì)被清除，說(shuō)明單純的HPV感染并不能致瘤，仍需要其他因素的參與[4]，這其中細(xì)胞內(nèi)遺傳性因素的改變可能具有更重要的意義。高危型HPV的持續(xù)感染，改變了宮頸上皮細(xì)胞的內(nèi)外環(huán)境，引起細(xì)胞內(nèi)非致死性的DNA損害，這種錯(cuò)誤的不斷積累導(dǎo)致宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化的可能急劇上升，最終導(dǎo)致癌的發(fā)生。研究已經(jīng)證實(shí)，HR-HPV在宮頸良性病變中以游離狀態(tài)存在為主，癌變過(guò)程中，在某些細(xì)胞內(nèi)外因素的觸發(fā)作用下，DNA整合到宿主細(xì)胞，游離態(tài)HR-HPV數(shù)量減少，E2表達(dá)中斷。當(dāng)E2表達(dá)降低到一定程度時(shí)，失去對(duì)共同存在的整合形式的HR-HPV的抑制作用，癌基因E6/E7表達(dá)增加[9，10]，E6/E7的過(guò)表達(dá)則增加了整合的HR-HPV的選擇優(yōu)勢(shì)和宿主染色體的不穩(wěn)定性。在E6/E7的作用機(jī)制中，E7引起染色體異常復(fù)制，導(dǎo)致宿主染色體不穩(wěn)定，使宿主細(xì)胞癌變，而E6能抑制抑癌基因p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并激活端粒酶[11]。亦有研究指出，p53基因被抑制后發(fā)揮作用的同時(shí)會(huì)對(duì)端粒酶基因及端粒酶的激活產(chǎn)生協(xié)同作用，促進(jìn)癌癥的發(fā)生。這提示HPV的致癌過(guò)程也與端粒酶及端粒酶基因密切相關(guān)。Snijder[12]等研究認(rèn)為HPV感染早于端粒酶基因水平上調(diào)，是端粒酶活化的原因。Aloysius[13]等也得出了同樣的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)HPV的作用十分迅速，在HPV的感染后的第一代細(xì)胞中就檢測(cè)到端粒酶的活性。Hopman等[14]也通過(guò)應(yīng)用FISH方法檢測(cè)CINⅡ/Ⅲ、微浸潤(rùn)癌和浸潤(rùn)性宮頸癌的hTERC基因和HPV整合，發(fā)現(xiàn)在HPV整合的雙倍體病變中，80%可見(jiàn)hTERC基因增加，且在hTERC基因增加的病例，HPV整合突出，提示了HPV整合與hTERC基因擴(kuò)增的平行及一致性。結(jié)合以往研究，人們推測(cè)端粒酶基因及端粒酶的激活可能是HPV致癌機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，繼發(fā)于HPV感染的宮頸上皮病變的發(fā)生仍需要端粒酶基因擴(kuò)增的參與作為首要補(bǔ)充，且這種基因的改變先于惡性基因轉(zhuǎn)變并伴隨著從ASCUS至CINⅢ的進(jìn)展[15]，是宮頸病變的早期事件。

3 端粒、端粒酶及端粒酶基因

可以看出，在針對(duì)宮頸癌的研究中，不管是染色體水平還是HPV致癌的分子水平均有端粒酶或端粒酶基因的指向，說(shuō)明端粒酶及端粒酶基因與宮頸癌變進(jìn)程有關(guān)，并可能在其中發(fā)揮了重要作用。端粒酶的意義是通過(guò)端粒的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。端粒是真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。端粒結(jié)構(gòu)對(duì)于真核染色體DNA復(fù)制過(guò)程中保持DNA長(zhǎng)度有非常重要的作用，如果沒(méi)有端粒，染色體之間就會(huì)相互粘連，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并可能以其他方式表現(xiàn)出錯(cuò)誤的行為，如降解、融合、重組和易位等，而這些錯(cuò)誤能夠嚴(yán)重地威脅染色體的生存和復(fù)制，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡和錯(cuò)誤復(fù)制[16]。由于DNA聚合酶不能完全復(fù)制染色體末端，因此，端粒的長(zhǎng)度隨著細(xì)胞分裂的不斷進(jìn)行而逐漸縮短，細(xì)胞趨向衰亡，被認(rèn)為是細(xì)胞分裂的“生物鐘”[17]。

端粒酶是影響端粒長(zhǎng)度的主要因素。它是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄核糖核蛋白酶，能以其自身的RNA為模板，向端粒末端添加( TTAGGG)n序列，以保持端粒的長(zhǎng)度和細(xì)胞的生存，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命甚至使其“永生”[18]。已經(jīng)有大量的研究顯示端粒酶活性的上調(diào)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。端粒酶在惡性腫瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)90%～100%，而正常人體細(xì)胞幾乎未檢出端粒酶的活性，現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為癌細(xì)胞正是由于端粒酶活性增強(qiáng)使染色體端粒維持在一定長(zhǎng)度而獲得了永生和無(wú)限增殖[19]。

人類端粒酶包括三個(gè)主要組成部分，人端粒酶RNA (human telomerase RNA component,hTERC)，人類端粒酶相關(guān)蛋白 1(human telomerase associated protein1,hTEP1)，人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)。其中hTERC為端粒酶的主體結(jié)構(gòu)，含有編碼端粒DNA的模板區(qū)、端粒酶蛋白結(jié)合區(qū)等。hTERC基因定位于3q26.3，是端粒酶延長(zhǎng)端粒的模板，同時(shí)在介導(dǎo)端粒酶組裝，活性調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用[20]。有研究表明，敲除編碼小鼠端粒酶RNA基因，端粒酶活性喪失，說(shuō)明了hTERC基因在端粒酶活性調(diào)控中的必要作用。

4 宮頸病變與hTERC基因

宮頸癌作為惡性腫瘤的一種，同樣適用于由端粒酶基因調(diào)節(jié)的端粒酶活性上調(diào)、端粒維持、細(xì)胞永生化而導(dǎo)致惡性病變發(fā)生的機(jī)制。Olaharski[21]等用FISH方法研究宮頸巴氏涂片中的端粒酶基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CINⅡ、CINⅢ中，端粒酶基因陽(yáng)性表達(dá)者分別占63%和76%，均與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩者之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，指出端粒酶基因的陽(yáng)性表達(dá)率和拷貝數(shù)隨宮頸病變的嚴(yán)重程度而增加，且在這些病例隨訪1～3年后，在端粒酶基因陽(yáng)性表達(dá)的病例中，可以觀測(cè)到CINⅠ/Ⅱ進(jìn)展到CINⅢ者占40.7%，提示這種基因組的擴(kuò)增改變是子宮頸癌前病變發(fā)展到浸潤(rùn)癌的重要條件甚至必需因素。Heselmeyer-HK等[15]也發(fā)現(xiàn)CINⅡ及CINⅢ的端粒酶基因陽(yáng)性表達(dá)率明顯區(qū)別于正常樣本、ASCUS及CINⅠ，其敏感性及特異性均能達(dá)到90%，且在從正常進(jìn)展到CIN3及浸潤(rùn)癌的婦女中，有33%的病例發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)臂的擴(kuò)增。而對(duì)于CINⅠ/CINⅡ到CINⅢ的敏感性檢測(cè)是100%，對(duì)于其退化的敏感性是70%。亦提示了端粒酶基因擴(kuò)增是子宮頸癌變的早期事件，且是宮頸癌變進(jìn)展的重要條件，通過(guò)對(duì)這種基因的檢測(cè)可以幫助識(shí)別低級(jí)別損害進(jìn)展的危險(xiǎn)性并減低細(xì)胞學(xué)篩查的假陰性率。這些研究均提示端粒酶基因可能成為宮頸病變的一種新的生物學(xué)標(biāo)記和獨(dú)立的檢測(cè)手段，可用于子宮頸癌的篩查及早期診斷，并能在一定程度上評(píng)估個(gè)體損害惡變的潛在危險(xiǎn)性。

5 關(guān)于FISH技術(shù)

人們?cè)卺槍?duì)宮頸病變的研究中發(fā)現(xiàn)了端粒酶基因在宮頸病變發(fā)生發(fā)展中的重要作用，提示端粒酶基因可能成為宮頸病變的一種獨(dú)立的檢測(cè)手段，并能在一定程度上評(píng)估個(gè)體損害惡變的潛在危險(xiǎn)性。通過(guò)對(duì)攜帶基因擴(kuò)增細(xì)胞的數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析使這種現(xiàn)象成為一種可應(yīng)用的識(shí)別標(biāo)志。

這種目標(biāo)基因的顯影就是通過(guò)應(yīng)用原位雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。目前，應(yīng)用比較廣泛的原位雜交技術(shù)是熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)。FISH是將細(xì)胞原位雜交技術(shù)和熒光技術(shù)有機(jī)結(jié)合而形成的新技術(shù)，其原理是基于堿基互補(bǔ)的原則，用熒光素標(biāo)記的已知外源DNA或RNA作探針，與載玻片上的組織切片、細(xì)胞涂片、染色體制片等雜交，特異的探針與待測(cè)核酸的靶序列專一性結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)雜交位點(diǎn)的熒光信號(hào)來(lái)顯示特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位[22]，并通過(guò)對(duì)這些項(xiàng)目的評(píng)定來(lái)探討或診斷疾病。

這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以在保持細(xì)胞形態(tài)完整性的條件下，檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)特定核酸的序列。與宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查相比，它直接對(duì)機(jī)體細(xì)胞中最穩(wěn)定的DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，更能從本質(zhì)上解釋和診斷疾病，且這種方法采取了量化診斷方式，避免了主觀偏差對(duì)診斷的影響，受主觀因素影響極小，更客觀可信。在技術(shù)上，F(xiàn)ISH標(biāo)本取材簡(jiǎn)單，可與細(xì)胞學(xué)同時(shí)取材，不增加患者的負(fù)擔(dān)；可用于間期細(xì)胞,不需要細(xì)胞培養(yǎng)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性較好，可在早期發(fā)現(xiàn)少量病變細(xì)胞的遺傳學(xué)異常，有利于對(duì)疾病的早期診斷和治療，有利于降低子宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。這為子宮頸癌的篩查及診斷提供了新的策略。

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2010年《大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》征訂啟事

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