刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體酶解條件的優(yōu)化

李艷麗，金周雨，李 玉*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體酶解條件的優(yōu)化

李艷麗1，金周雨1，李 玉2,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

以刺芹側(cè)耳菌絲為底物，利用溶壁酶進行原生質(zhì)體制備，考察酶解因素對原生質(zhì)體制備的影響。采用單因素試驗和正交試驗確定最佳酶解條件。結(jié)果表明：溶壁酶的最適酶解條件為最適酶解溫度30℃、pH6.0、底物質(zhì)量濃度133mg/mL、酶質(zhì)量分數(shù)1.0%、酶解時間2.5h，在此條件下，刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體的產(chǎn)量為6.34× 107個/mL。

溶壁酶；刺芹側(cè)耳；原生質(zhì)體；酶解條件；正交試驗

刺芹側(cè)耳學名為Pleurotus eryngii(DC.:Fr.) Qu è l.[1]，隸屬于真菌門、擔子菌亞門、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，中文名稱為刺芹側(cè)耳[2]。它是符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)界定的標準的18種珍稀食用菌之一，是高蛋白低脂肪的綠色食品[3]，此外，刺芹側(cè)耳多糖還具有提高免疫力等眾多藥理活性[4]。

為更好地開發(fā)利用這一珍稀食藥用菌資源，眾多的研究者展開了刺芹側(cè)耳高產(chǎn)栽培技術(shù)的研究，而對其優(yōu)良新菌株的選育工作報道甚少。與其他技術(shù)相比，原生質(zhì)體技術(shù)可以實現(xiàn)菌株的遠緣融合、基因轉(zhuǎn)化[5-10]和定向誘變[11-13]，產(chǎn)生更豐富的遺傳變異，因此漸已成為遺傳改良的重要工具。

作為原生質(zhì)體技術(shù)的重要前提，如何高效地制備原生質(zhì)體已成為研究者們共同關(guān)注的課題之一。本研究通過單因素試驗以及正交試驗系統(tǒng)地研究酶解因素對刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體制備的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺芹側(cè)耳菌株HB 吉林省食用菌業(yè)高新技術(shù)園區(qū)；溶壁酶 廣東省微生物研究所。

甘露醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、葡萄糖、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、VB1(均為國產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設備

LEICA-DM1000顯微鏡 德國徠卡儀器公司；凈化工作臺 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HZQ-C 空氣振蕩浴 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DK-420S三用恒溫水箱 上海精宏實驗設備有限公司；YXQLS-18S1不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 PDA固體培養(yǎng)基配制

馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。121℃，高壓滅菌30min，冷卻備用。

1.3.2 PDP綜合培養(yǎng)基配制

馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，硫酸鎂1.5g，磷酸二氫鉀3.0g，VB110mg，水1000mL。121℃，高壓滅菌30min，冷卻備用。

1.3.3 酶液的配制

精確稱取溶壁酶制劑，溶于含有0.6mol/L甘露醇的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，4000r/min離心10min，0.22μm無菌濾膜過濾，備用。

1.3.4 菌絲培養(yǎng)及收集

無菌條件下取固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌絲塊于液體培養(yǎng)基中，于25℃、100r/min搖床上避光培養(yǎng)5～6d，收集菌絲體，減壓抽濾，分別用無菌水和0.6mol/L無菌甘露醇清洗2次，備用。

1.3.5 原生質(zhì)體的制備與純化

參考于彥春等[14]的方法，略有改動。

1.3.6 最適酶解條件初步確定的單因素試驗

設置溫度為20、25、30、35℃，在pH5.5、酶質(zhì)量分數(shù)0.5%、底物質(zhì)量濃度100mg/mL條件下，水解1.0h，進行原生質(zhì)體制備，初步篩選最適溫度。然后，按此溫度進行最適pH值初步篩選實驗，分別設置pH值為4.0、5.0、6.0、7.0，其他條件同上。以此類推，按初步篩選的最適溫度和pH值進行最適底物質(zhì)量濃度的初步篩選，設置底物質(zhì)量濃度分別為33、66、133、200mg/mL。同理設置酶質(zhì)量分數(shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，初步確定最適酶質(zhì)量分數(shù)。

1.3.7 酶解條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對溫度、p H值、底物質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量分數(shù)4個酶解因素擬采用L9(34)進行正交試驗(表1)。

表1 酶解條件優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.3.8 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

根據(jù)正交試驗所得酶解條件，分別設置酶解時間為1.5、2.0、2.5、3.0、4.0h，考察其對刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，以確定最佳酶解時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溫度對原生質(zhì)體制備的影響

圖1 溫度對原生質(zhì)體制備的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on protoplast yield

如圖1所示，隨著水解溫度的升高，原生質(zhì)體個數(shù)迅速升高，達到30℃時，原生質(zhì)體個數(shù)最多，產(chǎn)量最大。之后再隨溫度升高，原生質(zhì)體個數(shù)隨之迅速下降。像所有的酶促反應一樣，溫度是影響酶活性的重要因素之一。溫度升高，溶壁酶活性也隨之升高。但酶是生物催化劑，在最適溫度之后，隨著溫度的再升高酶逐漸變性失活，活性反而下降，原生質(zhì)體個數(shù)因此降低。

2.1.2 pH值對原生質(zhì)體制備的影響

圖2 pH值對原生質(zhì)體制備的影響Fig.2 Effect of pH on protoplast yield

由圖2可知，當水解液pH6.0時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最大。在其左右兩側(cè)，原生質(zhì)個數(shù)均不同程度下降。由此可見，pH值對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響很大，pH6.0為其最適pH值。這是因為在pH6.0處，酶和菌絲細胞壁物質(zhì)均處于最佳解離狀態(tài)，最有利于酶發(fā)揮去壁活性，因此原生質(zhì)體產(chǎn)量最高。

2.1.3 底物質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體制備的影響

底物質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體制備的影響表現(xiàn)出3種狀態(tài)，如圖3所示，底物質(zhì)量濃度由33mg/mL增大至66mg/mL時，反應速度迅速增大。此后，酶解速度隨底物質(zhì)量濃度增加緩慢。當達到133mg/mL以后，原生質(zhì)體個數(shù)增加趨于平穩(wěn)。

圖3 底物質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體制備的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on protoplast yield

根據(jù)酶與底物結(jié)合形成中間復合物學說[15]，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度較低時，反應速度與底物質(zhì)量濃度呈正比。隨著底物質(zhì)量濃度的再增加，底物逐漸被酶飽和，反應速率上升不再明顯。當?shù)孜镔|(zhì)量濃度較大時，底物已被酶飽和，隨著底物質(zhì)量濃度再增加，體系已無多余的酶再與底物結(jié)合，因此反應速度不再增加，趨向于最大。

2.1.4 酶質(zhì)量分數(shù)對原生質(zhì)體制備的影響

圖4 酶質(zhì)量分數(shù)對原生質(zhì)體制備的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on protoplast yield

如圖4所示，酶質(zhì)量分數(shù)由0.5%增大至1.0%時，反應速度迅速增大，原生質(zhì)體產(chǎn)量迅速增加。此后，原生質(zhì)體個數(shù)隨酶質(zhì)量分數(shù)增加緩慢。這可能是因為酶逐漸被底物飽和的緣故。

2.2 正交試驗結(jié)果及分析

對影響原生質(zhì)體制備的酶解因素溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量分數(shù)進行四因素三水平正交試驗，結(jié)果如表2所示。對結(jié)果的極差分析可以看出，各因素影響的主次順序為A＞C＞D＞B，最佳配比為A2C3D1B3。正交試驗中優(yōu)選的最佳條件為A2B2C3D1。比較二者，僅B因素不同。由于B因素對制備的影響最小，綜合考慮，選取A2B2C3D1為最佳作用條件，即最適溫度為30℃、最適pH值為6.0、最適底物質(zhì)量濃度為133mg/mL、最適酶質(zhì)量分數(shù)為1.0%，水解1.0h，原生質(zhì)體產(chǎn)量為3.66×107個/mL。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental values of protoplast density in the hydrolysate

2.3 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

圖5 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on protoplast yield

如圖5所示，在正交試驗所得最佳酶解條件下，隨著水解時間的延長原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增大。當時間為2.5h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最大，達到6.34×107個/mL。此后，再增加水解時間，原生質(zhì)體產(chǎn)量反而下降。因此，選取2.5h為最佳酶解時間。

3 討 論

原生質(zhì)體的制備方法較多，但酶法最為常用。在酶的選擇上，國外通常以Novozyme234酶為主，國內(nèi)通常以溶壁酶為主進行原生質(zhì)體制備。Chang等[5]認為在某些菌株原生質(zhì)體的制備上，溶壁酶的活性優(yōu)于Novozyme234酶。鑒于溶壁酶較好的酶解效果，且與Novozyme234相比具有價格相對較低的優(yōu)點，本實驗選用溶壁酶作為原生質(zhì)體制備的酶制劑。

原生質(zhì)體的制備是一種酶促反應。酶促反應動力學

認為：影響酶促反應速度的因素包括反應溫度、p H值、底物質(zhì)量濃度、酶濃度、激活/抑制劑等[15]。本研究就是從酶促反應動力學出發(fā)，較系統(tǒng)地對影響原生質(zhì)體制備的酶解因素進行研究，確定使酶發(fā)揮最大活力的參數(shù)條件，從而最大程度地提高原生質(zhì)體產(chǎn)量。首先進行單因素試驗，初步篩選適合的酶解條件。通過單因素試驗，原生質(zhì)體產(chǎn)量由最初的9.60×106個/mL (圖1中30℃對應值)提高到1.63×107個/mL(圖4中1.5%對應值)。為進一步提高產(chǎn)量，進行正交試驗優(yōu)化酶解條件。正交試驗結(jié)果顯示，原生質(zhì)體產(chǎn)量由單因素試驗的1.63×107個/mL提高到3.66×107個/mL。此后又進行了水解時間的研究。原生質(zhì)體產(chǎn)量再一次提高，由3.66×107個/mL提高到6.34×107個/mL。由此看出，酶解因素對原生質(zhì)體制備具有重要影響，進行酶解條件的研究是十分必要的。此外，本實驗采用單因素試驗和正交試驗結(jié)合進行系統(tǒng)優(yōu)化的方法，使原生質(zhì)的產(chǎn)量得到了顯著提高。可見，試驗方案的設計是可行的，試驗優(yōu)化是十分必要的。

影響原生質(zhì)體制備的因素較多，酶解因素無疑是重中之重。但還包括諸如酶的種類、穩(wěn)滲劑的種類等因素的影響。有很少的文獻報道了刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體制備條件的研究[16-17]，雖然報道中包括對酶解條件的研究，但不夠全面和充分，且僅限于單因素研究。對酶解條件進行系統(tǒng)優(yōu)化研究尚未見報道。

[1]黃年來. 一種市場前景看好的珍稀食用菌: 刺芹側(cè)耳[J]. 中國食用菌, 1998, 17(6): 3-4.

[2]郭美英. 珍稀食用菌杏鮑菇生物學特性的研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報, 1998, 13(3): 44-49.

[3]GUNDE-CIMERMAN N. Medicinal value of the Genus pleurotus (Fr.) P. Karst. (agaricales S.I., basidiomycetes)[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, 1: 69-80.

[4]芮世華. 介紹幾種珍稀食用菌[J]. 中國食用菌, 2001, 20(16): 27-28.

[5]CHANG S T, LI G S F, PEBERDY J F. Isolation of protoplasts from edible fungi[J]. Mircen Journal, 1985, 1: 185-194.

[6]ZHAO J, CHANG S T. Intraspecific hybridization 4between Coprinus cinereus and Schizophyllum commune by PEG-induced protoplast fusion and electrofusion[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1995, 11: 585-590.

[7]ZHAO J, CHANG S T. Intergeneric hybridization between Pleutotus ostreatus and Schizophyllum commune by PEG-induced protoplast fusion[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1996, 12: 573-578.

[8]PENG Ming, LEMKE P A, SHAW J J. Improved conditions for protoplast formation and transformation of Pleurotus ostreatus[J]. Appl Microbio Biotechnol, 1993, 40: 101-106.

[9]李省印, 李孟樓, 胡彩霞, 等. 平菇種內(nèi)原生質(zhì)體分離與融合雜交育種技術(shù)的研究[J]. 生物技術(shù)通訊, 2004, 15(6): 580-583.

[10]王澄澈, 梁枝榮. 鳳尾菇和香菇原生質(zhì)體非對稱融合[J]. 菌物系統(tǒng), 2000, 19(3): 413-415.

[11]MUKHERJEE M, SENGUPTA S. Mutagenesis of protoplasts and regeneration of mycelium in the mushroom Volvariella volvacea[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1986, 52(6): 1412-1414.

[12]HOMOLKA L, VOLKOVI, NERUD F. Variability of enzymatic activities in ligninolytic fungi Pleurotus ostreatus and Lentinus tigrinus after protoplasting and UV-mutagenization[J]. Biotechnology Tehniques, 1995, 9(3): 157-162.

[13]李艷紅, 李莉. 原生質(zhì)體紫外誘變選育猴頭菌新菌株的研究[J]. 食用菌, 2006(5): 18-19.

[14]于彥春, 王丕武, 李玉. 榆黃蘑(Pleurotus citrinopileutus)原生質(zhì)體分離和再生的研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報, 1999, 21(2): 26-29.

[15]王鏡巖, 朱圣庚, 徐長進, 等. 生物化學[M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2002.

[16]劉敏, 李娟, 周波, 等. 杏鮑菇原生質(zhì)體制備與再生條件初探[J]. 生物技術(shù), 2005, 15(1): 54-55.

[17]陳敏, 蔣予箭, 姚善涇, 等. 杏鮑菇原生質(zhì)體制備技術(shù)的研究[J]. 食品科學, 2005, 26(8): 150-152.

Optimization of Enymolysis Conditions for Preparation of Pleurotus eryngii Protoplasts

LI Yan-li1，JIN Zhou-yu1，LI Yu2,*
(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Engineer Research Center of Edible and Medicinal Fungi, Ministry of Education, Changchun 130118, China)

The optimal conditions for the lywallzyme hydrolysis of the cultured mycelia of Pleurotus eryngii for protoplast production were investigated by single factor and orthogonal array design methods. Results showed that the optimal values of hydrolysis conditions were as follows: substrate concentration 133 mg/mL, enzyme dosage 1.0% and pH 6.0 for a hydrolysis duration of 2.5 h at 30 ℃. The hydrolysate obtained under such conditions exhibited a protoplast density of up to 6.34×107cells/mL.

lywallzyme；Pleurotus eryngii；protoplasts；enzymolysis conditions；orthogonal array design

S646

A

1002-6630(2010)10-0155-04

2009-08-07

李艷麗(1978—)，女，講師，碩士，研究方向為食藥用菌生物化學與分子生物學。E-mail：nongdalyl@yahoo.com.cn

*通信作者：李玉(1961—)，男，教授，博士，研究方向為菌類作物學、作物生態(tài)學及植物病理學。E-mail：yuli966@126.com