刺五加多糖的提取工藝及抗氧化活性研究

孟繁磊，陳瑞戰(zhàn)*，張 敏，陳瑞平

(長(zhǎng)春師范學(xué)院化學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130032)

刺五加多糖的提取工藝及抗氧化活性研究

孟繁磊，陳瑞戰(zhàn)*，張 敏，陳瑞平

(長(zhǎng)春師范學(xué)院化學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130032)

目的：研究刺五加多糖(Acanthopanacis senticosi polysaccharides，ASP)的超聲提取工藝及不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間的刺五加多糖含量及抗氧化活性，確定刺五加的最佳采收地點(diǎn)和時(shí)間。方法：采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取工藝參數(shù)、苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量；分別用FRAP法、鄰苯三酚自氧化及DPPH法測(cè)定刺五加多糖抗氧化活性。結(jié)果：超聲提取的最佳工藝條件為：提取溫度70℃、提取時(shí)間90min、超聲功率500W、提取次數(shù)3次；不同采集地點(diǎn)的刺五加多糖含量明顯不同，其中二參廠產(chǎn)刺五加多糖含量＞大湖產(chǎn)刺五加多糖含量＞興隆產(chǎn)刺五加多糖含量；而同一采集地點(diǎn)，隨著采收時(shí)間的推遲，多糖含量在6～8月呈增加趨勢(shì)，9月份以后多糖含量開始下降。抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明，12批不同來(lái)源的刺五加提取的多糖都具有較好的抗氧化活性，3種方法測(cè)定結(jié)果表明二參廠8月份采集的刺五多糖抗氧化活性最強(qiáng)。結(jié)論：優(yōu)選得到的刺五加超聲提取工藝穩(wěn)定可行；8月份采自二參廠的刺五加多糖含量和抗氧化活性最高。

刺五加；多糖；提取工藝；抗氧化活性

Abstract：The optimal procedure for the ultrasonic-assisted solvent extraction of Acanthopanacis senticosi polysaccharides(ASP) was investigated using orthogonal array design. The effects of different geographic origins and different harvesting times on polysaccharide content and antioxidant activity of crude ASPs from the leaves of Acanthopanacis senticosi were addressed.The phenol-sulfuric acid method was used for polysaccharide determination and the antioxidant activity of the ASP extract was tested by FRAP assay, pyrogallol autoxidation method and DPPH radical scavenging assay. The optimum conditions for the ultrasonic-assisted solvent extraction of ASP were found to be: extraction temperature 70 ℃ and ultrasonic power 500 W for 3-time extraction for 90 min each time. The polysaccharide contents of crude ASPs from different geographic origins were obviously different and decreased in the following order: Ershenchang ＞ Dahu ＞ Xinglong. With the harvesting time prolonged from June to August, crude ASPs from the same geographic origin exhibited an increasing trend in polysaccharide content;beyond September, an opposite pattern was observed. Antioxidant activity testing revealed that a total of 12 samples of crude ASPs from 3 geographic origins harvested during June-September, respectively were all strong antioxidants. The strongest antioxidant was the ASP extract from Ershenchang harvested in August.

Key words：Acanthopanacis senticosi；polysaccharides；extraction；antioxidant activity

多糖是指由10個(gè)或10個(gè)以上單糖聚合而成的一類生物大分子。研究發(fā)現(xiàn)多糖不僅具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗衰老等多方面藥理活性[1]，而且對(duì)物理的、化學(xué)的及生物來(lái)源的多種活性氧簇(ROS)具有良好的清除作用，能抑制UV所導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化、減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成，抑制體外H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血[2-4]，增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH2Px)活性等[5]，使多糖具有較好的抗氧化活性，而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑腫瘤、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一[6]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)[7-8]。加之多糖本身低毒、來(lái)源廣泛，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

刺五加(Acanthopanax senticocus(Rupr. et Maxim.)Harms)系五加科植物，主要分布在我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、河北等，是我國(guó)東北地區(qū)典型的藥用植物。中醫(yī)和本草綱目認(rèn)為，刺五加是補(bǔ)氣藥，能益氣健脾、補(bǔ)腎安神[9]，廣泛應(yīng)用于治療心臟病、高血壓、風(fēng)濕病、糖尿病等多種疾病[10-12]。刺五加中的有效成分包括刺五加多糖、刺五加總皂苷、異秦皮啶、β-谷甾醇、胡蘿卜苷、紫丁香樹脂醇苷等。研究表明，刺五加多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，尤其是對(duì)小鼠S180肉瘤和人白血病粒細(xì)胞K562作用顯著[13]。刺五加多糖是理想的免疫增強(qiáng)劑，它可以促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[14]，刺五加多糖還具有較強(qiáng)的抗氧化活性[15]。

本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間的刺五加葉為原料，采用正交試驗(yàn)來(lái)確定刺五加多糖超聲提取的最佳工藝，并對(duì)其多糖含量和總抗氧化活性及清除O2·和有機(jī)自由基DPPH進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為刺五加多糖藥物及功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12批刺五加葉為不同產(chǎn)地或相同產(chǎn)地不同采收期的樣品(表 3)。

1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH，純度90%)、三吡啶三吖嗪(TPTZ，純度98%)、抗壞血酸(VC) Sigma-Aidrich公司；苯酚、硫酸、鄰苯三酚、葡萄糖、無(wú)水乙醇、無(wú)水醋酸鈉、三氯化鐵等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2401型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；GENIOS酶標(biāo)儀 Tecan奧地利公司；ALPHA 2-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Chris公司；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 東京理化器械株式會(huì)社；KQ-500DE醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDL-40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將刺五加葉洗凈、烘干至質(zhì)量恒定，高速中藥粉碎機(jī)中粉碎，乙醚浸泡24h，揮干乙醚，殘?jiān)?5%的乙醇回流3h，殘?jiān)鼡]干溶劑，裝入自封袋備用。

1.3.2 刺五加多糖的提取工藝流程

1.3.2.1 刺五加多糖提取的單因素試驗(yàn)

在其他條件相同的條件下，分別研究提取溫度(40、50、60、70、80℃)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150min)、超聲功率(100、200、300、400、500W)、提取次數(shù)(1、2、3、4、5)4個(gè)單因素對(duì)刺五加多糖提取率的影響。

1.3.2.2 刺五加多糖提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以粗多糖提取率為篩選指標(biāo)，對(duì)影響刺五加多糖超聲提取的主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)L9(34)，確定超聲提取刺五加多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.3 刺五加多糖的含量測(cè)定

參照2005版《中國(guó)藥典》，采用苯酚-硫酸法測(cè)定。

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取105℃干燥后的葡萄糖103.8mg，加蒸餾水溶解，定容至100mL。得質(zhì)量濃度為1.038mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確量取0、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，置于100mL的容量瓶，加水定容至100mL，搖勻。精確量取上述各溶液2mL，加入1mL 5%苯酚試液，再加入5mL濃硫酸，室溫靜置10min，于40℃恒溫水浴15min，取出，迅速冷卻至室溫。于波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度c(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 粗多糖含量測(cè)定

分別稱取12批不同來(lái)源的刺五加提取得到的多糖(命名為ASP1～ASP12)各10mg，配成0.1mg/mL的供試液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測(cè)定吸光度。

式中：c為測(cè)得的樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為供試液體積/mL，本實(shí)驗(yàn)取100mL；m為供試品的質(zhì)量/mg；Y為多糖提取率/%；m為醇沉后得到的多糖質(zhì)量/g；m1為稱取的刺五加的質(zhì)量/g。

1.3.4 刺五加多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.3.4.1 鐵還原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP)法測(cè)定刺五加多糖總抗氧化活性

將醋酸鈉緩沖液(300mmol/L，pH3.6)、10mmol/L TPTZ(溶解在 40mmol/L HCl中)和 20mmol/L FeCl3溶液以10:1:1(V/V)的比例混合，配制成FRAP試劑(臨用前新鮮配制)。將VC標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為0.5mmol/L，樣品配成一定濃度(使樣品的吸光度與VC的吸光度相當(dāng))。取5μL VC標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液加入96孔酶標(biāo)板中，之后迅速加入FRAP試劑150μL。測(cè)定0min和4min標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品平行測(cè)定6個(gè)。結(jié)果以500μmol/L的VC為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算。

式中：ΔA＝A4min－A0min。

1.3.4.2 刺五加多糖對(duì)O2·的抑制作用[16]

試管中加入5mL 50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH8.20)和4.7mL蒸餾水，各管分別加入0.1mL不同濃度的刺五加多糖溶液，混勻后在25℃水浴20min，取出后立即加入3.0mmol/L鄰苯三酚0.20mL(25℃水浴，以10mmol/L HCl配制)，迅速搖勻后倒入比色杯。鄰苯三酚自氧化時(shí)以0.1mL蒸餾水代替多糖溶液。以10mmol/L HCl溶液作為參比，325nm波長(zhǎng)處每隔30s測(cè)定吸光度。多糖對(duì)O2·的抑制作用以抑制率表示。

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA為加入刺五加多糖溶液后鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.4.3 刺五加多糖對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用

取不同濃度的粗多糖待測(cè)樣品溶液0.5mL，加入2.5mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液，立即混勻，靜置0.5h后，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai。則多糖對(duì)DPPH·的清除率可表示為：

式中：Ai為DPPH與樣液反應(yīng)后的吸光度；Aj為樣品空白(樣品0.5mL+2.5mL 95%乙醇)的吸光度；Ac為未加樣的DPPH溶液(2.5mL DPPH+0.5mL 95%乙醇)的吸光度；每一樣品平行測(cè)3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，苯酚-硫酸法測(cè)定刺五加多糖含量的回歸曲線方程為A＝9.8414C－0.0488，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，線性范圍10～130μg/mL。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度的影響

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on ASP yield

由圖1可知，在40～60℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，反應(yīng)物的能量增加，多糖溶出率增加，提取率隨溫度的升高而增加，在60℃時(shí)提取率達(dá)到峰值。在60℃后，多糖提取率隨溫度的增加而降低，有可能是因?yàn)闇囟雀撸诔暤目栈饔煤透邷氐碾p重作用下使得多糖降解，從而使提取率降低。所以，超聲提取刺五加多糖的提取溫度選擇60℃較為適宜。

2.2.2 提取時(shí)間的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on ASP yield

由圖2可知，在 30～150min，多糖提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加，這是由于超聲波提取多糖的過(guò)程是原料中多糖成分不斷溶出并向提取液中擴(kuò)散的過(guò)程。剛開始時(shí)提取溶劑中多糖含量較低，而原料組織中多糖的含量為最大值，則多糖的濃度梯度最大，多糖成分由固體原料內(nèi)部向周圍提取溶劑擴(kuò)散的傳質(zhì)動(dòng)力較大，因此隨時(shí)間的增加多糖提取得率快速增加。隨著提取時(shí)間的增加，提取溶劑中多糖的含量逐漸增大，而同時(shí)原料組織中，多糖含量逐漸降低，則多糖物質(zhì)的濃度梯度不斷減少，至趨近于組織細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度平衡，所以在90～150min，多糖提取率增加較緩慢，綜合考慮，超聲法提取刺五加多糖提取時(shí)間選擇90min較為適宜。

2.2.3 超聲功率的影響

圖3 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on ASP yield

從圖3可以看出，在100～400W的功率范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增加，刺五加多糖提取率快速增加，在400W時(shí)出現(xiàn)峰值，超聲波功率超過(guò)400W刺五加多糖提取得率隨功率增加而逐漸降低。主要原因可能是較高的超聲功率下，超聲空化作用強(qiáng)，可加速組織細(xì)胞的破碎，促進(jìn)多糖提取率的快速增加。但當(dāng)超聲功率過(guò)大(超過(guò)400W)，導(dǎo)致空氣氣泡沒(méi)有足夠的時(shí)間潰陷時(shí)，超聲空化作用反而降低，同時(shí)在較大超聲功率作用下多糖可能發(fā)生降解等結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致提取得率下降。因此刺五加多糖提取超聲功率選擇400W較為適宜。

2.2.4 提取次數(shù)的影響

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction frequency on ASP yield

由圖4可知，多糖提取率隨著提取次數(shù)的增加而增加，原因可能是當(dāng)水進(jìn)入到刺五加組織細(xì)胞時(shí)，由于擴(kuò)散滲透作用水逐漸通過(guò)細(xì)胞壁透入到細(xì)胞內(nèi)，溶解了可溶性多糖，而造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，于是細(xì)胞內(nèi)的多糖不斷向外擴(kuò)散，水又不斷進(jìn)入刺五加組織細(xì)胞內(nèi)，如此多次往返，直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，將此飽和溶液濾出。連續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部分溶出。所以隨著提取次數(shù)的增加多糖的提取率逐漸增大，但從圖4可以看出當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次時(shí)，再增加提取次數(shù)，多糖提取率增大的幅度不大，而且消耗時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)，工作量加大，從經(jīng)濟(jì)等多方面綜合考慮，選擇最佳提取次數(shù)為3次。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)刺五加多糖提取得率影響較大的提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率、提取次數(shù)為因素，在各因素最佳值附近分別取3個(gè)水平(表1)，以多糖提取得率為指標(biāo)，做四因素三水平正交試驗(yàn)，依據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)表優(yōu)化多糖提取的最佳工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 刺五加多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results of ASP yield

由表2直觀分析表明，用超聲法提取刺五加多糖選擇水為溶劑，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最優(yōu)提取工藝為A3B2C3D2，即提取溫度70℃、提取時(shí)間90min、超聲功率500W、提取次數(shù)3次。刺五加多糖的最高提取率為10.04%。各因素對(duì)提取率的影響程度依次是超聲功率＞提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間。在此最優(yōu)條件下，取同一批次樣品，進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算超聲法提取刺五加多糖的平均提取率為10.87%，RSD為0.68%。結(jié)果表明優(yōu)化得到提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 不同產(chǎn)地、采集時(shí)間的刺五加多糖提取及含量測(cè)定結(jié)果

不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間的12批刺五加多糖提取工藝流程：

表3 刺五加多糖含量測(cè)定結(jié)果(±s)Table 3 Comparison of polysaccharide content among crude ASPs from the leaves of Acanthopanacis senticosi from different geographic origins harvested different harvesting times (±s)

表3 刺五加多糖含量測(cè)定結(jié)果(±s)Table 3 Comparison of polysaccharide content among crude ASPs from the leaves of Acanthopanacis senticosi from different geographic origins harvested different harvesting times (±s)

樣品來(lái)源 樣品名稱 多糖含量/% 樣品來(lái)源 樣品名稱 多糖含量/%興隆(6月) ASP1 49.45±0.0100 二參廠(8月)ASP7 66.17±0.0044興隆(7月) ASP2 54.52±0.0133 二參廠(9月)ASP8 60.42±0.0066興隆(8月) ASP3 58.00±0.0088 大湖(6月) ASP9 50.55±0.0055興隆(9月) ASP4 56.44±0.0077 大湖(7月)ASP10 55.74±0.0122二參廠(6月) ASP5 55.06±0.0100 大湖(8月)ASP11 60.17±0.0077二參廠(7月) ASP6 59.95±0.0144 大湖(9月)ASP12 57.34±0.0033

由表3可以看出，不同采集地刺五加多糖的含量是二參廠＞大湖＞興隆，原因可能是地理位置不同，溫度、濕度、土壤條件、光照時(shí)間等都不同，導(dǎo)致了不同地點(diǎn)刺五加多糖含量的差別；在同一地點(diǎn)采集的刺五加，6～8月多糖含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，9月份多糖含量有所下降。原因可能是植物的糖分積累，一般在生長(zhǎng)發(fā)育的早期，主要是淀粉等多糖物質(zhì)積累。隨著植物的成熟進(jìn)程，多糖類物質(zhì)會(huì)慢慢轉(zhuǎn)化為單糖或雙糖物質(zhì)，當(dāng)多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化得差不多時(shí)，單糖或雙糖積累到一定程度，這時(shí)就進(jìn)入植物生長(zhǎng)的成熟階段。當(dāng)植物中糖類物質(zhì)再往下轉(zhuǎn)化時(shí)，當(dāng)多糖完全轉(zhuǎn)化為單糖，單糖又逐漸分解，植物就達(dá)到十成熟了。6～8月是刺五加生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，所以多糖含量呈增加趨勢(shì)，到了9月份以后，刺五加已經(jīng)進(jìn)入成熟時(shí)期，是多糖轉(zhuǎn)化為單糖，單糖又逐漸分解的過(guò)程。所以，9月份以后，刺五加多糖的含量又開始下降。由此可以初步判斷8月份是刺五加的最佳采收時(shí)間。

2.5 刺五加多糖總抗氧化活性

圖5 刺五加多糖的總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果Fig.5 Comparison of total antioxidant capacity of among crude ASPs from different geographic origins harvested different harvesting times

在低pH值的溶液中，F(xiàn)e3+-TPTZ (Fe3+-吡啶三吖嗪)可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價(jià)鐵形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于593nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，根據(jù)吸光度大小計(jì)算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱。采用鐵還原/抗氧化能力(FRAP)分析法評(píng)估不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間刺五加多糖總抗氧化活性結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間的刺五加多糖參照VC來(lái)看，都具有一定的鐵還原/抗氧化能力。其中，二參廠產(chǎn)刺五加多糖抗氧化能力最強(qiáng)，其次是興隆和大湖產(chǎn)刺五加多糖。對(duì)于同一采收地點(diǎn)的鐵還原/抗氧化能力也是隨著采收時(shí)間的推遲，6～8月呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，9月份有所下降。FRAP法測(cè)定12批刺五加多糖總抗氧化能力之所以是這樣的結(jié)果，主要與其含量等因素有關(guān)。因?yàn)樗从车牟皇菢悠丰槍?duì)某一種自由基的清除活性，而是樣品總還原能力，反映樣品總抗氧化活性。FRAP法測(cè)定12批刺五加多糖總抗氧化能力進(jìn)一步確定了刺五加的最佳采收時(shí)間和地點(diǎn)：8月份采自二參廠。

2.6 對(duì)O·的抑制作用

鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化釋放O2·，并生成有色中間產(chǎn)物，該有色中間產(chǎn)物在325nm波長(zhǎng)處有一特征吸收峰，當(dāng)有抑制劑存在時(shí)，可清除O2·，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，所以，可通過(guò)比色法來(lái)檢測(cè)有色中間產(chǎn)物的含量，以檢測(cè)物質(zhì)清除O2·的能力。

本實(shí)驗(yàn)利用這一特點(diǎn)，測(cè)定不同時(shí)間反應(yīng)體系的吸光度，測(cè)得鄰苯三酚自氧化速率和加入刺五加多糖后鄰苯三酚自氧化速率，間接測(cè)刺五加多糖對(duì)O2·的抑制率，結(jié)果見圖6～9。

圖6 興隆不同采收期刺五加多糖對(duì)O2·的抑制作用Fig.6 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from Xinglong harvested at different times

由圖6～9可以看出，12批不同來(lái)源刺五加多糖，對(duì)鄰苯三酚自氧化法反應(yīng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基均具有一定的抑制能力，且多糖質(zhì)量濃度和對(duì)O2·抑制能力具有一定的量效關(guān)系：隨著多糖濃度的增大對(duì)超O2·抑制能力也逐漸增強(qiáng)。其中，對(duì)于同一地點(diǎn)采集的刺五加多糖而言，其抑制O2·能力，也是隨著采收時(shí)間的推遲，6～8月呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，9月份有所下降；而對(duì)于不同產(chǎn)地采集的刺五加提取多糖，二參廠采收的刺五加提取的多糖抑制O2·能力最強(qiáng)，其次是大湖和興隆產(chǎn)刺五加多糖；這主要是，不同時(shí)間地點(diǎn)采收的刺五加多糖含量不同，導(dǎo)致了其對(duì)O2·的抑制作用不同。此結(jié)果，也表明刺五加最佳的采收時(shí)間地點(diǎn)分別是8月份采自二參廠。

圖7 二參廠不同來(lái)收期刺五加多糖對(duì)O2·的抑制作用Fig.7 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from Ershenchang harvested at different times

圖8 大湖不同采收期刺五加多糖對(duì)O2·的抑制作用Fig.8 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from Dahu harvested at different times

圖9 不同地點(diǎn)8月份采集刺五加多糖對(duì)O2·的抑制作用Fig.9 Comparison of superoxide anion free radical scavenging activity among crude ASPs from different geographic origins harvested in August

2.7 對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其溶液具有特征的紫紅色吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的單電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。

反應(yīng)體系中清除自由基DPPH的相對(duì)百分率，以VC為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑與樣品進(jìn)行比較，作出清除率隨濃度變化的曲線(以濃度為橫坐標(biāo)，清除自由基DPPH的百分率為縱坐標(biāo))，計(jì)算出對(duì)自由基清除率達(dá)50%的清除劑用量來(lái)評(píng)價(jià)其清除自由基DPPH的能力(即半抑制濃度，IC50)，結(jié)果見圖10。

圖10 刺五加多糖對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用結(jié)果Fig.10 Comparison of DPPH free radical scavenging activity among crude ASPs from different geographic origins harvested at different times

刺五加多糖對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用，結(jié)果以IC50表示，IC50的值越小，說(shuō)明刺五加多糖的抗氧化活性越強(qiáng)。由圖10可以看出，12批不同來(lái)源的刺五加多糖對(duì)有機(jī)自由基DPPH都有一定的清除作用，其中，ASP7的清除有機(jī)自由基DPPH的能力強(qiáng)于VC(IC50為0.1400mg/mL)，其IC50為0.1245mg/mL。這12批不同來(lái)源的刺五加多糖對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用結(jié)果，和多糖含量測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)相同，這說(shuō)明主要起清除有機(jī)自由基DPPH的活性物質(zhì)是刺五加多糖，其含量的多少，直接影響了對(duì)自由基DPPH的清除結(jié)果。此結(jié)果也表明8月份在二參廠采集刺五加是其最佳的采收時(shí)間和地點(diǎn)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了刺五加多糖的超聲提取工藝，通過(guò)正交試驗(yàn)得到了最優(yōu)提取工藝參數(shù)：提取溫度為70℃，提取時(shí)間為90min，超聲功率為500W，提取次數(shù)為3次。不同來(lái)源的刺五加提取的多糖含量測(cè)定結(jié)果表明，不同采集地點(diǎn)的刺五加多糖含量：二參廠＞大湖＞興隆，而同一采集地點(diǎn)，隨著采收時(shí)間的推遲，多糖含量在6～8月呈增加趨勢(shì)，9月份以后多糖含量開始下降；抗氧化活性測(cè)定結(jié)果表明，12批不同來(lái)源的刺五加提取的多糖都具有一定的抗氧化活性，其中ASP7顯示出較好的效果，F(xiàn)RAP值為781.82μmol/L，明顯優(yōu)于VC的500 μmol/L，O2·的抑制作用為45.47%，對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用的IC50為0.1245mg/mL，優(yōu)于對(duì)照品VC，所以，刺五加最佳的采收時(shí)間和地點(diǎn)為8月份采自二參廠。結(jié)果為刺五加綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)方法奠定了基礎(chǔ)。

[1] 李義, 陳星, 李紅霞, 等. 馬蘭水溶性粗多糖提取工藝的研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2006, 22(1): 161-163.

[2] 朱曉宦, 吳向陽(yáng), 仰榴青, 等. 馬齒覓粗多糖的提取及清除羥自由基活性作用[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2007, 17(1): 57-60.

[3] TROMMER H, NEUBERT R H H. The examination of polysaccharides as potential antioxidative compounds for topicaladministration using a lipid model system[J]. International Journal of Pharmaceutics,2005, 298(1): 153-163.

[4] 劉娟, 鄧澤元, 于化泓. 決明子水溶性多糖的抗氧化作用[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(5): 61-63.

[5] 羅麗萍, 高蔭榆, 洪雪娥, 等. 薯蔓黃酮和多糖體內(nèi)抗氧化作用研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(8): 408-410.

[6] 丁保金, 金麗琴, 呂建新. 多糖生物活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志,2004, 39(8): 561-564.

[7] 翼伸. 怎樣研究植物多糖[J]. 生命的化學(xué), 1999, 19(6): 296-297.

[8] 鄭晶泉. 抗氧化劑抗氧化實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2000, 27(1): 37-38.

[9] 曹先蘭, 李珠蓮. 刺五加國(guó)內(nèi)外研究概況[J]. 中成藥, 1980, 11(6):10-14.

[10] LI Xiaolan, ZHOU Aiguo. Preparation of polysaccharides from Acanthopanax senticosus and its inhibition against irradiation induced injury of rat[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 67(26): 219-226.

[11] YI J M, HONG S H, KIM J H, et al. Effect of Acanthopanax senticosus stem on mast cell-dependent anaphylaxis[J]. J Ethnopharmacol, 2002,79(3): 347-352.

[12] YI J M, KIM M S, SEO S W, et al. Acanthopanax senticosus root inhibits mast cell-dependent anaphylaxis[J]. Clin Chim Acta, 2001, 312(1/2): 163-168.

[13] 佟麗, 黃添友, 吳波, 等. 植物多糖抗腫瘤作用與機(jī)理研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 1995, 7(l): 5-9.

[14] 謝蜀生, 許士凱, 張文仁, 等. 刺五加多糖免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華腫瘤雜志, 1989, 11(5): 338-340.

[15] 孟慶繁, 于笑坤, 徐睦蕓, 等. 刺五加多糖的提取及其抗氧化性[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào): 理學(xué)版, 2005, 43(5): 683-686.

[16] 勞鳳云, 劉正猛, 王洪波. 淡豆豉多糖的提取及其清除自由基的活性研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2008, 35(10): 1909-1910.

Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Acanthopanacis senticosi Leaves

MENG Fan-lei，CHEN Rui-zhan*，ZHANG Min，CHEN Rui-ping
(College of Chemistry, Changchun Normal University, Changchun 130032, China)

S566.9

A

1002-6630(2010)10-0168-07

2009-08-19

孟繁磊(1984—)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物分析研究。E-mail：mengfanlei622@163.com

*通信作者：陳瑞戰(zhàn)(1967—)，男，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物有效成分提取及分離研究。E-mail：ruizhanchen@163.com