變色液體培養(yǎng)基用于結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)的研究

張傳興

（山東省血液中心，山東 濟南 250014）

結(jié)核病的發(fā)病率呈在我國呈上升趨勢,對結(jié)核病的診斷基層醫(yī)院承擔著重要的工作,目前結(jié)核病的實驗室診斷主要有細菌學檢驗、免疫學檢驗及分子生物學診斷方法,后兩種因為方法學還未完善,假陽性和假陰性率較高。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)分離仍然是診斷結(jié)核病的 “金標準",是藥物敏感性檢測的基礎(chǔ)。近年來,變色液體培養(yǎng)基的應(yīng)用受到越來越多的重視[1],為了評價此種檢驗方法的優(yōu)劣并評估其在我們醫(yī)院的應(yīng)用情況,我們進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

所有患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、X線或CT檢查和臨床治療轉(zhuǎn)歸證實而確診為活動性肺結(jié)核,其中男108例,女92例,年齡(39±8)歲。

1.2 標本來源

200份痰標本均取自2002年7月至2008年5月在齊魯醫(yī)院和千佛山醫(yī)院的住院和門診的肺結(jié)核病人的新鮮晨痰,為清晨漱口后輕咳,留取肺深部積痰2mL以上,置入無菌管中備檢。

1.3 實驗方法

每份標本先行涂片檢查,然后經(jīng)2～4倍體積的4%NaOH消化20min,離心10min,用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀物,后加入該液400μL混勻,同時嚴格按操作規(guī)程進行BACT/ALERT 3D、L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)法和變色液體培養(yǎng)基的檢驗。

1.4 實驗試劑

L-J培養(yǎng)基按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》配制；快速變色液體培養(yǎng)基由深圳怡百世生物技術(shù)有限公司提供商品化試劑盒,其主要成分為:磷酸鹽緩沖液、谷氨酸鈉、維生素、微量元素、甘油、馬血清、變色劑以及多種抗生素,嚴格按試劑盒操作說明進行操作；BACT/ALERT 3D按照說明書進行操作。

1.5 結(jié)果判斷

改良羅氏培培養(yǎng)法接種后3 d、7 d和之后每周觀察結(jié)果,有菌落生長并涂片證實后判為陽性[2],并記錄檢出時間,兩月后無菌落生長判為陰性;快速變色培養(yǎng)基每24h觀察結(jié)果1次,兩周后每3d觀察1次,若培養(yǎng)基變?yōu)樽霞t色或有紫紅色沉淀,經(jīng)涂片證實為抗酸桿菌為陽性,記錄檢出時間,1月后不變色視為陰性。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

快速液體變色培養(yǎng)法與圖片法、BACT/ALERT 3D、L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)法的比較結(jié)果見表1?？焖僖后w變色培養(yǎng)法與涂片法相比陽性率高并且有顯著性差異外,高于L-J培養(yǎng)法，低于BACT/ALERT法,但與兩者比較均無顯著性差異。

對涂片法陽性和陰性的再用快速液體變色培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)果見表2。

表1 200例肺結(jié)核患者痰液標本的幾種檢測率比較

表2 快速液體變色培養(yǎng)法與涂片法的比較

快速液體變色培養(yǎng)法對涂片陽性119例的檢出率為91.6%;對涂片法81例陰性的檢出率為85.19%。χ2檢驗有統(tǒng)計學意義。日常工作中，只做涂片，會有誤差，兩者結(jié)合，結(jié)果會更可靠。

快速液體變色培養(yǎng)法平均檢出時間為5.6 d,改良L-J培養(yǎng)基的平均檢出時間為14.9 d,BACT/ ALERT 3D平均時間也是14天，前者時間明顯短余后兩者，說明快速液體變色培養(yǎng)基更利于結(jié)核病的早期診斷。

3 討論

新的結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)基及快速培養(yǎng)方法的探索為分枝桿菌的培養(yǎng)分離提供了新的思路,但大多數(shù)方法尚未得到大樣本標本的檢驗,沒有得到公認,不能取代傳統(tǒng)方法。本實驗所用的快速液體變色培養(yǎng)基為營養(yǎng)豐富并含抗生素的選擇性培養(yǎng)基,通過多種抗生素抑制其他微生物的生長,當有活的分枝桿菌存在時,并將以每繁殖一代15h～20h的速度生長(高于固體培養(yǎng)基中的(20h～24 h)[3],并隨生長過程中氧的消耗,對氧敏感的色素物質(zhì)變?yōu)樽霞t色,從而顯示陽性結(jié)果。

此方法與涂片法相比陽性率顯著較高,也高于L-J培養(yǎng)法,而與涂片法結(jié)合使用可使陽性率大大提高。在檢測時間上,遠遠短于L-J培養(yǎng)法,相對更能達到快速診斷的目的。檢驗過程不需特殊儀器,商品化的試劑盒也避免了繁雜的L-J培養(yǎng)基的配制工作,大大簡化了操作過程,提高了效率。BACT/ ALERT BACTEC MGIT 960系統(tǒng)、BACTEC 9000 MB系統(tǒng)、ESPⅡ、MB/BacT等全自動分離培養(yǎng)技術(shù)系統(tǒng)具有快速、敏感、高效、無放射性污染等優(yōu)點，但費用昂貴,污染率較高,尚需進一步改進和完善。

熊禮寬等[1]研究表明,變色液體培養(yǎng)基總陽性率(53.2%)高于L-J培養(yǎng)基(8.3%)[4]。趙錦等[5]研究表明,從細菌生長周期看,變色液體培養(yǎng)基平均生長天數(shù)為10d,明顯短于L-J培養(yǎng)基(平均為25d)。但變色液體培養(yǎng)基污染率(6.9%)略高于L-J培養(yǎng)基(4%),差異無顯著性(0.25＜P＜0.5)。其原因可能與標本前處理及洗滌沉淀中操作程序有關(guān)。此外,變色液體培養(yǎng)基結(jié)果判斷尚有主觀性,且變色時間持續(xù)較短,僅2～3d紫色即消失,需及時觀察結(jié)果。因此，該培養(yǎng)基在如何選擇穩(wěn)定性強的指示劑方面尚待進一步探索和改進。該培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性率高,檢出時間快,污染率低,操作簡便、經(jīng)濟、實用、不需特殊儀器設(shè)備。具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

[1]熊禮寬,楊應(yīng)用,黃煒.一種新型快速檢出分枝桿菌變色液體培養(yǎng)基的評價[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2001,24(1):49.

[2]金法祥,湯佳良,祝桂瑯.結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)[J].臨床檢驗雜,2004,2(2):235-236.

[3]熊國亮,張慧慧,雷建平.變色液體培養(yǎng)基快速檢測分枝桿菌的臨床應(yīng)用評價[J].江西醫(yī)學檢驗,2003,21:69270.

[4]Noordhoek G T,Arend H J.Gunnar B.Sensitivity and specificity ofPCR for detection of Mycobacterium tuberculosis:a blind comparision study among seven laboratories[J].Journals of Clinical Micro2biology,1994,32(3):277-284.

[5]趙錦，徐萍，王強，等，分枝桿菌快速變色液體培養(yǎng)基臨床應(yīng)用的評價[J].中國防癆雜志,2006,28(2):125-126.