荷葉生物堿對牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞兒茶酚胺分泌的影響

臧忠良，毛浩萍，柴麗娟，郭 浩，高慶瑋，劉昌孝，高秀梅

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津市中藥藥理重點實驗室;2.天津藥物研究院，天津 300193)

兒茶酚胺(catecholamine，CA)(包括去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺)是機(jī)體維持正常生命活動的內(nèi)源性物質(zhì)，參與機(jī)體生理應(yīng)激變化，太過或不及均會造成病理性損傷。研究表明，兒茶酚胺與許多疾病有關(guān)，如心腦血管疾病、精神病、肥胖、免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)疾病等。通過藥物干預(yù)兒茶酚胺的分泌和合成對于預(yù)防和治療與兒茶酚胺相關(guān)的疾病具有十分重要的意義。

荷葉(Folium Nelumbinis)是睡蓮科蓮屬植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)的葉，具有清暑利濕、升發(fā)清陽、清心去熱、止血利水的功效?，F(xiàn)代臨床研究表明［1］，荷葉具有降脂減肥、抗氧化與抗衰老、抑制脂肪肝、抑菌、抗病毒、抗炎、抗過敏等作用。荷葉中含有多種生物堿和黃酮類化合物，其中生物堿是荷葉產(chǎn)生強(qiáng)烈抗有絲分裂作用的主要活性成分之一［2］。近年來研究表明［3］，荷葉生物堿(alkaloids from Folium Nelumbinis)通過阻斷鈣離子的跨膜運(yùn)動能弛緩去甲腎上腺素和KCl誘導(dǎo)的小鼠肌肉收縮，調(diào)節(jié)神經(jīng)反射。鑒于荷葉生物堿的藥理作用與兒茶酚胺異常導(dǎo)致疾病有一定相關(guān)性，本文體外培養(yǎng)擬交感活性的牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞，研究荷葉生物堿對牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞中兒茶酚胺分泌的影響，為荷葉生物堿的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品和試劑牛腎上腺購自天津市北辰屠宰場。KRP 緩沖液由 154 mol·L－1NaCl，5.6 mmol·L－1KCl，1.1 mmol·L－1MgSO4，2.2 mmol·L－1CaCl2和 10 mmol·L－1葡萄糖組成，調(diào)節(jié) pH 至7.4;高鉀溶液為含56 mmol·L－1K+的KRP緩沖溶液;MEM培養(yǎng)基和新生牛血清購自Gibcon(美國Nitrogen公司 );膠原酶購自 Nitta Zerachin(日本大阪);乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、藜蘆定堿(veratridine，Ver)、腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)均購自 Sigma(美國);乙二胺四乙酸二鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、高氯酸(PCA)等均為國產(chǎn)分析純，甲醇、乙腈為國產(chǎn)色譜純;荷葉購自安國藥材市場，荷葉生物堿由本實驗室提取分離，含量為50%，其中荷葉堿含量為3.64%。

1.2 儀器Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);DECADEⅡ電化學(xué)檢測器(荷蘭ANTECLEY DEN公司);臺式ALLEGRA-64R高速離心機(jī)(美國貝克曼公司);熒光成像酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1.1 牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 取新鮮的牛腎上腺用組織切片器切取牛腎上腺髓質(zhì)，按照Yanagihara等［4］所述方法用膠原酶消化成單個細(xì)胞后，以每孔5×105個細(xì)胞的密度種植48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，美國)，培養(yǎng)于含10%新生牛血清、1×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素、0.25 mg·L－1兩性酶素B和3μmol·L－1阿糖胞苷的 MEM 培養(yǎng)基中。置于37℃含5%CO2/95%空氣細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d內(nèi)使用。

2.1.2 牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞中CA的分泌 將培養(yǎng)的牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞用KRP緩沖液沖洗3次后于37℃水浴中孵育，分別加入240 μl反應(yīng)液 (含荷葉生物堿0.005～50 mg·L－1及相應(yīng)刺激劑的KRP緩沖液或含荷葉生物堿的高K+緩沖液)37℃孵育10 min，10 min 后取出反應(yīng)液，加入 60 μl 2 mol·L－1PCA溶液終止反應(yīng)。HPLC-ECD［5］檢測腎上腺素和去甲腎上腺素的量，兩者之和作為細(xì)胞分泌CA的量。

收集細(xì)胞板上反應(yīng)液后，取對照孔細(xì)胞，用240 μl去離子水(KRP緩沖液)洗刮收集細(xì)胞懸液，加入60 μl 2 mol·L－1PCA。3 000 r·min－1離心 10 min后，取上清液 30 μl，加 270 μl去離子水稀釋，用HPLC檢測腎上腺素和去甲腎上腺素，兩者之和的10倍作為細(xì)胞總CA量。兒茶酚胺分泌量用細(xì)胞分泌CA量占細(xì)胞總CA量的百分比表示。

2.1.3 牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞中CA分泌的檢測 色譜柱:SymmetryShieldTMRP18Column(3.9 mm×150 mm，5 μmol·L－1，Waters公司，美國);流動相:甲醇 ∶乙腈 ∶水(含磷酸二氫鉀0.1 mol·L－1、EDTA-Na20.1 mmol·L－1，辛烷磺酸鈉 0.25%，pH 3.4)=12 ∶1 ∶87;流速:1 ml·min－1;柱溫:35℃;ECD工作電壓為+0.7 mV，量程范圍0～200 nA;進(jìn)樣量:10 μl。

2.1.4 鈣流的檢測 細(xì)胞消化成單個后，以每孔5×104個細(xì)胞的密度種植于清潔黑底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Greiner，美國)中，于37℃含5%CO2/95%空氣細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，取出細(xì)胞并加入鈣-4 試劑(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，37℃孵育CO2培養(yǎng)箱中90 min。然后，用熒光成像酶標(biāo)儀FlexstationⅢ(Molecular Devices，USA)機(jī)械臂加入含荷葉生物堿及刺激劑的溶液，同時以熒光檢測法檢測細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)熒光值(熒光分析波長為:λex=485 nm，λem=525 nm，檢測時間5 min)。數(shù)據(jù)用相對熒光單位(RFU)表示，即熒光單位(RFU)與0 s時的RFU百分率之比。

3 結(jié)果

3.1 荷葉生物堿對牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞中不同刺激劑誘導(dǎo)的CA分泌的影響結(jié)果表明:ACh、Ver、高鉀溶液均能刺激牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞中CA的分泌。而50 mg·L－1荷葉生物堿能抑制 ACh、Ver、高鉀誘導(dǎo)的 CA的分泌，其抑制率分別為:42.86%，35.33%，37.46%。與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Effects of alkaloids from Folium Nelumbinis on secretagogues-induced CA secretion( ± s，n=3)

3.2 不同濃度荷葉生物堿對ACh、Ver、高鉀誘導(dǎo)的CA分泌的影響結(jié)果顯示:在0.5、5、50 mg·L－1荷葉生物堿均能抑制ACh、Ver誘導(dǎo)的CA分泌(IC50值分別為 34.85、41.62 mg·L－1)，分別與單用ACh、Ver相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，P＜0.01)。0.05～50 mg·L－1荷葉生物堿均能抑制高鉀誘導(dǎo)的 CA分泌(IC50=27.63 mg·L－1)，與單用高鉀相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意度(P＜0.05，P＜0.01)。Fig 2所示。以上結(jié)果說明，荷葉生物堿能通過ACh、Ver、高鉀3個通道抑制兒茶酚胺的分泌，且均具有劑量依賴關(guān)系。

Fig 2 Effect of alkaloids from Folium Nelumbinis on ACh induced catecholamines secretion( ± s，n=3)

3.3 不同濃度荷葉生物堿對乙酰膽堿誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響300 μmol·L－1ACh能明顯增加牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞中鈣離子濃度，40～60 s細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度達(dá)到高峰(Fig 3)。不同濃度的荷葉生物堿對ACh引起的鈣離子內(nèi)流具有濃度依賴性抑制作用。與300 μg·L－1ACh組相比，5～50 mg·L－1荷葉生物堿從40～300 s內(nèi)能降低ACh引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05～0.01)。

Fig 3 Time course of intracellular calcium rising induced by acetylcholine in bovine adrenal medullary cells(±s，n=3)

以上結(jié)果表明:荷葉生物堿抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高與抑制兒茶酚胺分泌結(jié)果一致，說明荷葉生物堿通過煙堿型乙酰膽堿受體抑制鈣離子濃度升高，減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而達(dá)到減少兒茶酚胺分泌作用。

4 討論

腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞主要由嗜鉻細(xì)胞組成，來源于胚胎神經(jīng)嵴，它與交感節(jié)后神經(jīng)元具有許多相同的生理和藥理學(xué)特性。腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞中兒茶酚胺分泌機(jī)制與交感神經(jīng)系統(tǒng)中兒茶酚胺分泌類似，已廣泛應(yīng)用于生化、電生理、神經(jīng)藥理等各領(lǐng)域的研究。在體外培養(yǎng)的腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞膜上至少有3種不同類型的離子通道參與了CA的分泌［6］:① 煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)離子通道，②電壓門控Na+通道和，③電壓門控Ca2+通道。而乙酰膽堿、藜蘆定堿和56 mmol·L－1高鉀溶液能分別作用于上述3種離子通道而促進(jìn)CA的分泌，其作用機(jī)制與交感神經(jīng)元細(xì)胞中去甲腎上腺的分泌和合成機(jī)制類似。因此牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞可以作為擬交感模型應(yīng)用于心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肥胖等藥物研究。

兒茶酚胺在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)正常功能上占有舉足輕重的作用，但是由于應(yīng)激引起的兒茶酚胺分泌可過量參與并加重諸如心衰、動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等［7］心血管原發(fā)性疾病。因此研究其在預(yù)防和治療與兒茶酚胺相關(guān)的疾病方面具有重要意義。中醫(yī)藥由于其良好的臨床療效和副作用少等特點而日益成為當(dāng)前研究的熱點。但目前藥物對兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)分泌及其機(jī)制的研究國外以化學(xué)藥物為主，僅見日本和韓國等少數(shù)實驗室有相關(guān)的中藥研究報道。我們前期研究證實，開竅中藥［8］、丹參酮等［9］能明顯抑制兒茶酚胺的分泌，這也是上述藥物發(fā)揮心腦血管保護(hù)作用的機(jī)制之一。除此之外，我們還以腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞為模型，對飛蓬草［10］進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果顯示，飛蓬草提取物具有明顯抑制兒茶酚胺分泌和細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流的作用。

荷葉在食用和藥用兩方面都具有廣泛的應(yīng)用，除傳統(tǒng)記載清暑利濕、升發(fā)清陽等功效外，近期研究表明荷葉中的生物堿類成分具有降脂減肥、降低血壓、抗心率失常、解痙攣等作用［11］。此項研究結(jié)果表明，荷葉生物堿可以抑制細(xì)胞膜上 nACh受體激動劑ACh、電壓依賴型鈉離子通道開放劑Ver、電壓依賴型鈣離子通道開放環(huán)境的高鉀介導(dǎo)的CA的分泌，且具有劑量依賴性，同時又能明顯抑制ACh誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣內(nèi)流。說明荷葉生物堿通過減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)揮抑制CA分泌，此項研究結(jié)果提示荷葉除應(yīng)用于中暑之外，可用于糖脂代謝異常、肥胖、高血壓、心腦血管病等疾病。

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