鞘內(nèi)注射p-MPPF對異氟烷鎮(zhèn)痛作用的影響

馬 濤，袁力勇，王 丹，戴體俊，郭忠民，張勵才

異氟烷(isoflurane，Iso)鎮(zhèn)痛作用突出，理化性質(zhì)穩(wěn)定，全麻效能高，對呼吸循環(huán)影響小，毒性低，是臨床上廣泛應(yīng)用的吸入麻醉藥(inhaled anesthetics)。但Iso的麻醉機制目前尚未明確，在諸多麻醉作用中，鎮(zhèn)痛作用是最重要、最基本的作用之一。目前認為Iso的鎮(zhèn)痛部位主要在脊髓，可能與脊髓甘氨酸(Glycine，Gly)、谷氨酸(Glutamic acid，Glu)、神經(jīng)元煙堿(neuronal nicotinic acetylcholine，nACh)和腎上腺素 α2等受體有關(guān)［1－8］。研究發(fā)現(xiàn)［9］，脊髓中不同的 5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)受體亞型介導了5-HT對傷害性信息的調(diào)制，其中，脊髓5-HT1A受體與疼痛的關(guān)系密切［10－13］。目前，關(guān)于Iso的鎮(zhèn)痛作用與脊髓5-HT1A受體的關(guān)系罕見文獻報道。

本研究以小鼠腹腔注射(intraperitoneal injection，ip)Iso建立鎮(zhèn)痛模型，觀察鞘內(nèi)注射(intrathecal injection，it)5-HT1A受體的拮抗劑p-MPPF(4-Fluoro-N-(2-［4-(2-methoxyphenyl)1-piperazinyl］ethyl)-N-(2-pyridinyl)benzamide dihydrochloride)對Iso鎮(zhèn)痛作用的影響，以分析此作用與脊髓5-HT1A受體的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥品和儀器 藥品:Iso，魯南貝特制藥有限公司，批號:080908;p-MPPF，Sigma公司，用人工腦脊液(artificial cerebral spinal fluid，aCSF)稀釋成所需濃度;冰醋酸，上海建信化工有限公司試劑廠，批號:XK13-2010942。儀器:HH-42型快速恒溫數(shù)顯水箱(常州國華電器有限公司);YLS-6B智能熱板儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);微量進樣器(上海醫(yī)用激光儀器廠);FA1104電子天平(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 甩尾法［14］小鼠♀♂各半。將快速恒溫數(shù)顯水箱加熱到48℃ ±0.5℃。在小鼠尾巴的下1/3做一標記，把標記以下尾巴浸入水中，記錄鼠尾自進入水中到甩出水面的時間即甩尾潛伏期(tail-flick latency，TFL)。給藥前，每只小鼠測TFL兩次，間隔5 min，將TFL＜3 s或＞6 s的小鼠淘汰，取兩次的平均值作為基礎(chǔ)TFL。各小鼠第2次給藥后測定5、12、20、27、35 min 的 TFL，最長觀察時間為15 s。

1.3.2 熱板法［14］均為♀小鼠。將YLS-6B智能熱板儀調(diào)至55℃，用藥之前測小鼠自放到熱板上到舔后足的時間，即熱板痛閾(pain threshold in hotplate test，HPPT)2 次，間隔10 min，挑選 HPPT 在 10～20 s之間的小鼠，取兩次的平均值作為基礎(chǔ)HPPT。第 2 次給藥后測定 5、15、25、35 min 的HPPT。

1.3.3 醋酸扭體法［14］小鼠♀♂各半，第2次給藥5 min后ip 1.0%冰醋酸0.1 ml·10 g－1致痛，觀察各組小鼠15 min內(nèi)的扭體次數(shù)(writhing times，WTs)。

1.3.4 鞘內(nèi)注射［15］以左手掌心壓住鼠身，拇、中二指按壓骶骨兩側(cè)固定，食指按在雙骶骨前緣連線正中點皮膚上(可觸知L6棘突)指示進針點，右手持微量注射器與脊柱上方成20°角與 L5－6間隙進針，針尖進入一側(cè)棘突與橫突間組織后減成10°角仔細緩慢推進，以鼠尾出現(xiàn)突然側(cè)向運動為成功標志。緩慢注藥，注射容積為5 μl，注射持續(xù)5 s，留針 10 s。

1.4 實驗分組和給藥方法 每種方法60只小鼠隨機分為6組，分別為:Control組，Iso鎮(zhèn)痛組(Iso組)，單用工具藥組:M6組、M3組，合用藥組:Iso+M6組、Iso+M3組，每組10只小鼠。Control組:ip NS0.1 ml·(10 g)－11 min 后 it aCSF;Iso組:ip Iso(熱板法和扭體法:0.3 ml·kg－1，甩尾法:0.4 ml·kg－1)1 min后 it aCSF;M6組、M3組:ip NS 1 min后it 6 μg 或 3 μg p-MPPF/只;Iso+M6組、Iso+M3組:ip Iso 1 min 后 it 6 μg 或 3 μg p-MPPF/只。

2 結(jié)果

2.1 甩尾法 單獨it p-MPPF對小鼠TFL無明顯影響(vs Control組，P ＞0.05)，見 Tab 1。ip Iso后產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛作用(P＜0.01);it 6 μg p-MFFP在5、12、20、27、35 min時使小鼠 TFL 縮短(vs Iso組，P ＜0.01)，可恢復到接近用藥前水平(P＞0.05);it 3 μg p-MFFP也能使TFL縮短(vs Iso組，P＜0.01或P＜0.05)，不如大劑量p-MFFP作用明顯，見Fig 1。

Fig 1 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon TFL in isoflurane treated mice

2.2 熱板法 單用p-MPPF組的HPPT和Control組相似(P＞0.05)，見Tab 2。ip Iso鎮(zhèn)痛作用明顯且可持續(xù)35 min之久(P＜0.01);it 6 μg p-MPPF在5、15、25、35 min 時使小鼠的 HPPT 降低(vs Iso組，P＜0.01)，與用藥前差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);it 3 μg p-MPPF也可使 HPPT降低(vs Iso組，P ＜0.01或P＜0.05)，但不如大劑量p-MPPF作用明顯，見Fig 2。

Tab 1 Influence of intrathecal injection of p-MPPF on TFL in mice(tail-flick test，ˉ ± s，n=10)

Tab 1 Influence of intrathecal injection of p-MPPF on TFL in mice(tail-flick test，ˉ ± s，n=10)

Group TFL/s Base 5 min 12 min 20 min 27 min 35 min Control 4.6 ±1.7 4.0 ±1.3 4.9 ±2.2 3.9 ±1.9 5.1 ±2.2 4.8 ±1.8 M6 4.9 ±2.1 4.7 ±1.9 3.7 ±1.4 3.6 ±2.6 4.5 ±2.5 3.5 ±2.3 M3 4.2 ±1.2 4.4 ±2.4 4.8 ±2.5 3.8 ±1.8 3.6 ±1.9 5.2 ±2.6

Fig 2 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon HPPT in isoflurane treated mice

Tab 2 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon HPPT in mice(hot-plate test，ˉ±s，n=10)

Tab 2 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon HPPT in mice(hot-plate test，ˉ±s，n=10)

Group HPPT(s)Base 5 min 15 min 25 min 35 min Control14.3 ±3.0 14.7 ±3.2 14.9 ±3.9 15.2 ±4.214.1 ±5.3 M6 15.2 ±5.1 14.2 ±3.5 14.7 ±5.6 13.9 ±2.8 15.0 ±4.1 M3 14.4 ±4.5 14.5 ±6.9 15.1 ±5.8 14.0 ±3.4 14.6 ±3.2

2.3 醋酸扭體法 與Control組相比，ip Iso鎮(zhèn)痛作用明顯(P＜0.01)而單獨it p-MPPF對小鼠15 min內(nèi)的WTs影響不大(P＞0.05);it 6 μg p-MPPF使小鼠 WTs增加(vs Iso組，P ＜0.05);it 3 μg p-MPPF對 WTs無影響(vs Iso組，P ＞0.05)，見 Fig 3。

Fig 3 Influence of intrathecal injection of p-MPPFon WTs in isoflurane treated mice

3 討論

甩尾反射的中樞在脊髓［14］。預實驗中我們發(fā)現(xiàn)，甩尾法中ip 0.4 ml·kg－1Iso雖可產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)靜作用，但對脊髓反射活動影響很小，因此與另外兩種方法(熱板法和扭體法)使用的Iso劑量有所不同。實驗中選用的工具藥p-MPPF是高選擇性的5-HT1A受體的拮抗劑，比p-MPPI活性更強。在預實驗中，單獨it p-MPPF的劑量達到 12.5 μg/只，除 1只小鼠有尿失禁現(xiàn)象外，其它小鼠自主活動正常，無興奮、驚厥現(xiàn)象。逐漸降低p-MPPF劑量至6 μg/只，仍可明顯拮抗Iso的鎮(zhèn)痛作用，故本研究中工具藥 p-MPPF it最高劑量為6 μg/只。

分布于脊髓的5-HT1受體亞型主要有5-HT1A、5-HT1B、5-HT1C和 5-HT1D受體，研究發(fā)現(xiàn)［13］，脊髓背角神經(jīng)元上的5-HT1A受體與傷害性信號傳導過程密切相關(guān)。在甩尾實驗［10］、福爾馬林實驗［11］和電刺激實驗中［12］，it 5-HT產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用均可被5-HT1A受體阻斷劑削弱或取消;it或脊髓微電泳5-HT1A受體激動劑也呈現(xiàn)出明顯的抗傷害效應(yīng)［16］。在福爾馬林致痛實驗中，對乙酰氨基酚的鎮(zhèn)痛作用也被5-HT1A受體的阻斷劑取消［13］。本研究結(jié)果表明，Iso體表抗傷害作用能夠被it p-MPPF所拮抗，說明脊髓5-HT1A受體參與Iso鎮(zhèn)痛過程，而且這種拮抗作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。在扭體實驗中，大劑量p-MPPF(6 μg)能拮抗Iso的鎮(zhèn)痛作用，小劑量p-MPPF(3 μg)無作用，與其他兩種方法實驗結(jié)果對比，拮抗強度減弱。這可能與體表物理刺激和腹腔化學刺激的痛反射途徑不同有關(guān)。脊髓5-HT1A受體可能是Iso對體表熱刺激產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的重要靶位，而與Iso對抗內(nèi)臟化學刺激作用關(guān)系不大。

與以上結(jié)果不同，另一些研究顯示［17］，it 5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT和Buspirone可明顯增強小鼠的甩尾反射，提示5-HT1A受體介導了痛覺的易化效應(yīng)。這可能是由于給藥方式、用藥劑量、工具藥的特異性以及觀察指標和實驗過程等的差異引起的。誠如Grasshoff所言［18］，疼痛的產(chǎn)生及調(diào)控是涉及多部位多機制的復雜過程，因此吸入麻醉藥鎮(zhèn)痛作用的具體受體機制還有待進一步研究。

［1］ 陳 ?，李惠萍，戴體俊，等.士的寧敏感的甘氨酸受體對吸入麻醉藥催眠和鎮(zhèn)痛作用的影響［J］.中國藥理學通報，2007，23(5):604－7.

［1］ Chen Y，Li H P，Dai T J，et al.Effects of strychnine-sensitive glycine receptor on the hypnotic and analgesic effects of inhalation anesthetics［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(5):604 －7.

［2］ 杭黎華，戴體俊，曾因明.鞘內(nèi)注射NMDA拮抗吸入麻醉藥的鎮(zhèn)痛作用［J］.中國藥理學通報，2005，21(9):1062 －5.

［2］ Hang L H，Dai T J，Zeng Y M.Effects of intrathecal injection of NMDA on the analgesia of inhalation anesthetics［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(9):1062 －5.

［3］ 杭黎華，邵東華，楊映紅，等.AMPA對吸入麻醉藥催眠、鎮(zhèn)痛作用的影響［J］.中國藥理學通報，2007，23(12):1571 －5.

［3］ Hang L H，Shao D H，Yang Y H，et al.Effcets of AMPA on the hypnotic and analgesic effects of inhalation anesthetics［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(12):1571 －5.

［4］ 閆 肅，戴體俊，曾因明.鞘內(nèi)注射煙堿對異氟烷、七氟烷鎮(zhèn)痛作用的影響［J］.中國疼痛醫(yī)學雜志，2008，14(6):352 －5.

［4］ Yan S，Dai T J，Zeng Y M.Effects of intrathecal injection of nicotine on the analgesic actions of isoflurane and sevoflurane［J］.Chin J Pain Med，2008，14(6):352 －5.

［5］ 閆 肅，戴體俊，曾因明.神經(jīng)元煙堿受體與異氟烷、七氟烷催眠和鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系［J］.中國藥理學通報，2008，24(3):318－22.

［5］ Yan S，Dai T J，Zeng Y M.Relationship between neuronal nicotinic acetylcholine receptors and the hypnotic and analgesic effects of isoflurane and sevoflurane［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):318－22.

［6］ 張 虹，彭春龍，姜夢露，等.鞘內(nèi)注射育亨賓對異氟烷鎮(zhèn)痛作用的影響［J］.徐州醫(yī)學院學報，2008，28(10):664 －6.

［6］ Zhang H，Peng C L，Jiang M L，et al.The effect of intrathecal injection with yohimbin on the analgesia of isoflurane［J］.Acta Acad Med Xuzhou，2008，28(10):664 －6.

［7］ 馬 濤，戴體俊，王 丹，等.異氟烷體表抗傷害作用與脊髓α2受體的關(guān)系［J］.中國醫(yī)藥導報，2009，6(36):17 －9.

［7］ Ma T，Dai T J，Wang D，et al.The relationship between the surface antinociceptic effects of isoflurane and α2adrenoceptors in spinal cord［J］.China Med Herald，2009，6(36):17 －9.

［8］ 閆 肅，戴體俊，程 偉.全身麻醉藥鎮(zhèn)痛作用受體機制的研究進展［J］.中國藥理學通報，2008，24(10):1272 －5.

［8］ Yan S，Dai T J，Cheng W.Research progress on receptor mechanisms of analgesia of general anesthetics［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(10):1272 －5.

［9］ Calejesan A A，Chang M H，Zhuo M.Spinal serotonergic receptors mediate facilitation of a nociceptive reflex by subcutaneous formalin injection into the hindpaw in rats［J］.Brain Res，1998，798(1 －2):46－54.

［10］Xu W，Qiu X C，Han J S.Serotonin receptor subtypes in spinal antinociception in the rat［J］.J Pharmacol Exp Ther，1994，269(3):1182－9.

［11］Korzeniewska I，P＇|a＇znik A.Influence of serotonergic drugs on restraint stress induced analgesia［J］.Pol J Pharmacol，1995，47(5):381－5.

［12］Nadeson R，Goodchild C S.Antinociceptive role of 5-HT1Areceptors in rat spinal cord［J］.Br J Anaesth，2002，88(5):679 －84.

［13］Gjerstad J，Tjolsen A，Hole K.The effect of 5-HT1Areceptor stimulation on nociceptive dorsal horn neurones in rats［J］.Eur J Pharmacol，1996，318(2 －3):315 －21.

［14］宋必衛(wèi)，徐叔云，馬傳庚，等.鎮(zhèn)痛藥物實驗法［M］//徐叔云，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學.3版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:882－95.

［14］Song B W，Xu S Y，Ma C G，et al.Experimentations of analgesic drugs［M］//Xu S Y，Bian R L，Chen X，chief editor.Emethodology of pharmacological experiment.3rd ed，Beijing:People's Sanitation Press，2002:882 －95.

［15］Hylden J L，Wilcox G L.Intrathecal morphine in mice:a new technique［J］.Eur J Pharmacol，1980，67(2 －3):313 －6.

［16］Millan M J，Seguin L，Honore P，et al.Pro-and antinociceptive actions of serotonin(5-HT)1Aagonists and antagonists in rodents:relationship to algesionmetric paradigm［J］.Behav Brain Res，1996，73(1－2):69－77.

［17］Alhaider A A，Wilcox G L.Differential roles of 5-Hydroxytryptamine1Aand 5-Hydroxytryptamine1Breceptor subtypes in modulating spinal nociceptive transmission in mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，1993，265(1):378－85.

［18］Grasshoff C，Rudolph U，Antkowiak B.Molecular and systemic mechanisms of general anaesthesia:the multi-site and multiple mechanisms'concept［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2005，18(4):386－391.