動物生理節(jié)律影響藥物代謝過程的分子基礎及其調節(jié)機制的研究進展

曾憲成，馬 璟

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203)

目前，由于體外研究技術手段的局限性及藥品注冊相關法規(guī)的要求，動物整體實驗在藥物研究與開發(fā)領域中仍發(fā)揮著不可替代的重要作用。藥物在人或動物體內的動態(tài)過程是其藥效或毒性作用產生的前提。給藥時間不同，藥物吸收、分布、代謝及排泄 (absorbance，distribution，metabolism and excretion，ADME)等藥動學參數(shù)也將發(fā)生變化，即藥物體內的動力學過程存在時間節(jié)律性。本文總結了國內外動物生理節(jié)律影響體內藥物作用過程及其機制等方面的研究進展。

1 藥理或毒理學實驗中動物生理節(jié)律現(xiàn)象

在藥理或毒理學實驗中，最重要的就是確定劑量-效應之間的關系，然而在實驗設計及結果分析時主要關注劑量設置及其對應的藥效或毒性反應，而常常忽略給藥時間對上述結果的影響。小鼠在不同時間點 ip給予鎮(zhèn)痛藥曲馬朵(tranadol)后，于24:00(暗中期)給藥急性死亡率最高，于4:00(暗后期)給藥鎮(zhèn)痛作用較強;另外，其體內藥代動力學參數(shù)亦呈現(xiàn)出給藥時間依賴性［1］。大鼠分別于12:00(光照飼養(yǎng)期)及24:00(黑暗飼養(yǎng)期)給予氯唑沙宗(chlorzoxazone)后，前者血液消除半衰期(t1/2)顯著長于后者，但其經細胞色素P450 CYP2E1(cytochrome P-450 CYP2E1，CYP2E1)酶的代謝產物6-羥基氯唑沙宗(6-hydroxychlorzoxazone)8 h血漿濃度-時間曲線下面積(the area under the curve from 0 to 8 h，AUC0～8h)卻明顯短于后者［2］。大鼠給藥時間不變，但當取樣時間改變后，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)誘導的小鼠骨髓微核率也具有時間節(jié)律性，在末次給藥后6 h達到最高［3］。

2 腸道藥物轉運體的生理節(jié)律性表達及其調節(jié)機制

許多藥物發(fā)揮其療效主要取決于其跨越細胞屏障到達靶部位的能力，脂溶性藥物通過被動擴散可以穿越腸道屏障而不需要特異的轉運系統(tǒng)，但親水性藥物需要特異的轉運體系進行跨膜轉運。因此，在多種口服藥物的動物體內吸收過程中，腸道轉運蛋白發(fā)揮著重要作用。

2.1 腸道轉運體的生理節(jié)律性表達

在腸道黏膜中有多種藥物轉運蛋白，包括介導藥物吸收的有機陰離子轉運多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP)、有機陽離子轉運體(organic cation transporter，OCT)、肽轉運體 1(peptide transporter 1，PEPT1)、單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporter，MCT)和多藥耐藥相關蛋白 1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)和MRP2，介導藥物外排的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)。雄性SD大鼠空腸黏膜多藥耐藥蛋白1(multidrug-resistance protein 1，MDR1)，MCT1，MRP2，PEPT1及BCRP在轉錄水平呈現(xiàn)出時間節(jié)律性，MCT1及BCRP在光照期表達量最高，MRP2及PEPT1在黑暗期表達量最高［4］。PEPT1蛋白質及mRNA水平在雄性Wistar大鼠十二指腸的表達呈現(xiàn)出生理節(jié)律性，其mRNA及蛋白質的峰值表達均出現(xiàn)在20:00，谷值表達出現(xiàn)在 8:00［5］。 Na+-葡 萄 糖 共 轉 運 體 1(sodium-glucose co-transporter 1，SGLT1)，葡萄糖轉運體2(glucose transporter 2，GLUT2)及GLUT5是嚙齒類動物小腸主要表達的幾種己糖(hexose)轉運體。雄性C57BL/6小鼠十二指腸及空腸中SGLT1，GLUT2及GLUT5表達在蛋白質及mRNA水平均呈現(xiàn)出時間節(jié)律性;十二指腸中mRNA在15:00表達量達峰值，而蛋白質表達量在9:00達峰值;空腸中SGLT1 mRNA表達量在21:00達峰值，GLUT2和GLUT5 mRNA在15:00達峰值，三種蛋白質表達的峰值水平均出現(xiàn)在3:00，其中GLUT2可以維持到9:00;而回腸中三者僅在mRNA水平被觀察到有時間節(jié)律性，它們的峰值表達量出現(xiàn)在21:00［6］。雄性大鼠十二指腸中SGLT1的mRNA及蛋白質峰值表達量均出現(xiàn)在20:00，而峰谷表達量出現(xiàn)在8:00［5］;空腸中其 mRNA表達量在16:00達峰值，蛋白質的峰值表達則出現(xiàn)于22:00;但在回腸中僅mRNA水平表現(xiàn)出時間節(jié)律性，它在22:00表達量達峰值［7］。闡明上述葡萄糖轉運體的時間節(jié)律性規(guī)律及其調節(jié)機制不僅有助于推動多種疾病如糖尿病、肥胖性疾病和吸收紊亂等的治療，另外也將推動對上述轉運體參與的藥物動力學時間節(jié)律性的認識，因為槲皮素-4'-β-葡糖苷(quercetin-4'-β-glucoside)和槲皮素-3-葡糖苷(quercetin-3-glucoside)已被證實是 SGLT1 的典型底物［8－9］。

2.2 腸道轉運體生理節(jié)律性表達的調節(jié)機制

下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)及外周組織如肝臟、心臟、脂肪組織及小腸等的生物鐘共同構成了機體節(jié)律計時系統(tǒng)(circadian timing system)，且兩者在組成成分及調節(jié)機制方面基本相同，主要由一系列相互聯(lián)系的反饋回路(feedback loop)組成;時鐘蛋白(clock protein)及腦和肌肉組織芳香羥受體核轉運蛋白的類似蛋白1(brain and muscle ARNT-like 1，BMAL1)組成了正向調節(jié)支路(positive limb)，周期時鐘蛋白(period clock protein，PER)1、PER2、藍光受體隱花色素 (cryptochrome，CRY)1及CRY2組成了負向調節(jié)支路(negative limb);孤兒核受體Rev-erbα組成了另一條反饋調節(jié)支路;富含脯氨酸和酸性氨基酸堿性亮氨酸拉鏈(proline and acidic amino acid-rich basic leucine zipper，PARbZip)的轉錄因子白蛋白基因D位點結合蛋白(albumin gene D-site binding protein，DBP)、肝性白血病因子(hepatic leukemia factor，HLF)及促甲狀腺素胚胎因子(thyrotroph embryonic factor，TEF)共同組成了用于介導機體生物鐘下游反應的輸出性調節(jié)子(output regulators)［10－12］。其中，DBP蛋白在調節(jié)生理節(jié)律性反應時發(fā)揮著十分重要的作用。一方面DBP蛋白通過與PER1啟動子區(qū)結合而與時鐘蛋白及BMAL1形成的復合物共同誘導其轉錄，另一方面DBP轉錄分別受到時鐘蛋白-BMAL1復合物誘導及PER和CRY蛋白抑制調控［13］。DBP在小腸的時間節(jié)律表達時相與PEPT1蛋白一致，并且通過與PEPT1啟動子區(qū)結合而誘導PEPT1轉錄［14］。因此DBP在PEPT1生理節(jié)律性表達中發(fā)揮著重要作用。迷走神經在機體許多內部器官功能調節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，同時它也參與了腸道葡萄糖轉運體時間節(jié)律性調節(jié)。大鼠腹部迷走神經被切除后，空腸 SGLT1、GLUT5及GLUT2 mRNA的表達仍具有生理節(jié)律性，但 SGLT1及GLUT2蛋白質水平的時間節(jié)律性表達未曾見到，迷走神經似乎通過mRNA轉錄后或翻譯后加工參與葡萄糖轉運體生理節(jié)律性調節(jié)［15］。但是，迷走神經不參與SGLT1蛋白質水平的時間節(jié)律性表達目前尚存在爭議［16］。堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子腺病毒E4啟動子結合蛋白4(adenovirus E4 promoter ATF site binding protein 4，E4BP4)及HLF通過競爭結合相同DNA位點而對小腸MDR1a基因轉錄產生不同方向的調節(jié)作用;E4BP4含量在體內周期性波動，僅在含量高時抑制MDR1a轉錄，HLF對MDR1a的轉錄具有活化作用［17］。

3 肝臟藥物代謝酶的生理節(jié)律性表達及其調節(jié)機制

肝臟是迄今已知最重要的藥物代謝器官。藥物代謝酶在外源性或內源性化合物代謝或解毒過程中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)它們參與的藥物代謝反應時相，可分為Ⅰ相酶和Ⅱ相酶，Ⅰ相酶主要有肝微粒體中CYP450;Ⅱ相酶主要有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、谷胱甘肽-S-轉移酶 (glutathione S-transferases，GST)、磺基轉移酶(sulfotransferases，SULT)和N-乙酰基轉移酶(N-acetyltransferases，NAT)等。另外肝臟還分布有參與藥物轉運的多種轉運體，包括P-gp、MRP、BCRP及MDR等。

3.1 肝臟藥物代謝酶的生理節(jié)律性表達

早期對肝臟藥物代謝酶生理節(jié)律性的研究主要通過監(jiān)測酶活性及相應代謝產物含量。小鼠GST活性光照期(7:00－19:00)高于黑暗期(19:00－7:00)，且具有底物特異性，24 h 內分別作用 1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，CDNB)與 1，2-環(huán)氧-3-(對硝基苯氧基)丙烷［1，2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propane，EPNP］2 種底物，相應酶活性的峰谷值出現(xiàn)的時相是相反的，酶與CDNB反應的峰值出現(xiàn)在13:00，谷值在1:00［18］?；蛐酒夹g可以同時觀察影響機體的許多重要生理功能基因的生理節(jié)律性表達。在Fisher 344雄性大鼠3906個基因中，1171(30%)個基因可被清晰的觀察到具有時間節(jié)律性，其中1029個(88%)基因峰值表達增加倍數(shù)小于1.5，在67個顯著性表達增加的基因中包含CYP4A3的基因及推定的乙?；D移酶camello 4(putative N-acetyltransferase camello 4，Clm4)的基因，肝CYP4A酶異構體主要通過催化生成20-羥二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acids)而調節(jié)腎動脈和腎小管離子轉運，Clm4在芳香胺及聯(lián)氨乙?；磻邪l(fā)揮著重要作用［19］。在CD-1雄性小鼠肝臟2122個基因中，187(8.8%)個基因的表達呈現(xiàn)出明顯的時間節(jié)律性，其中與藥物代謝有關的有GSTθ2，CYP17，CYP2A4及 CYP2E1，四者 mRNA 表達均在夜間達到最高［20］。另外CYP2C22、羧酸酯酶基因及gst基因在小鼠肝臟中亦呈節(jié)律性表達，GST的cDNA峰值表達出現(xiàn)在8:00，CYP2C22及羧酸酯酶的cDNA峰值表達則出現(xiàn)在20:00［21］。小鼠肝臟Ⅰ相藥物代謝酶的mRNA通常在黑暗期表達增加;CYP2B10的峰值表達出現(xiàn)在2:00，而峰谷表達則出現(xiàn)在2:00;CYP2E1及CYP3A11的峰值表達則分別出現(xiàn)在22:00和2:00;CYP1A2的峰值表達出現(xiàn)在6:00;CYP4A14的節(jié)律性表達略顯復雜一點，它在光照期會維持在一個較為穩(wěn)定的水平，在18:00表達量達峰值，至黑暗中期(22:00－2:00)下降至峰谷水平，在光照期又恢復至較高水平［22］。Ⅱ相酶 mRNA的表達多數(shù)在光照期達到峰值;UGTLA家族的UGT1A1，UGT1A6及UGT1A9和UGT2家族的UGT2A3，UGT2B35及UGT2B36峰值表達量均出現(xiàn)在14:00，而UGT1A5在2:00表達量最高，UGT2B34在6:00表達量最高;SULT1A1，SULT1D1及SULT5A1的峰值表達出現(xiàn)在光暗過渡期;GSTA1，GSTA2，GSTA4，GSTM1，GSTM2，GSTM3，GSTM4及GSTM6的最高表達均出現(xiàn)在光照早期10:00，最低表達則出現(xiàn)在黑暗中期22:00，GSTT1在光暗過渡期6:00和18:00表達量會升高，而GSTT2在黑暗期會增加表達［22］。BCRP，MRP2及MDR2在24 h內的表達波動幅度小于2倍，但MDR1的波動幅度卻超過2.9倍，且在22:00出現(xiàn)峰值表達［22］。上述研究結果表明，參與動物體內藥物處置過程的肝臟藥物代謝酶和轉運體及其亞型mRNA的表達多數(shù)具有生理節(jié)律性，而且峰谷值出現(xiàn)時相不一。在使用藥物時應該首先弄清楚參與該藥體內處置過程的肝臟藥物代謝酶和轉運體的種類，然后結合這些酶和轉運體表達及功能的生理節(jié)律性設計出合理的給藥和取樣時間，以獲取最大藥效或者更多不良反應等信息。

3.2 肝臟藥物代謝酶生理節(jié)律性表達調節(jié)機制

肝臟藥物代謝酶生理節(jié)律性表達受到肝臟自身時鐘基因的調節(jié)。在Wistar大鼠肝臟中，PER2、BMAL1、DBP、核受體超家族成員1d1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，Nr1d1)及Nr1d2 5種時鐘基因的表達呈現(xiàn)出明顯的生理節(jié)律性［23］。當小鼠肝臟BDP，TEF及HLF三種基因同時被敲除后，組成型雄烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)調節(jié)的CYP450酶CYP4A和CYP2C，CAR調節(jié)的多種藥物代謝酶，包括CYP2B及CYP3A等Ⅰ相酶，GST及UGT等Ⅱ相酶，ATP結合盒蛋白(ATP binding cassette，ABC)G2、ABCC4(MRP4)、ABCA8A、ABCA6 及 ABCB1B 等藥物轉運體，氨基乙酰丙酸合酶1(aminolevulinic acid synthase 1，ALAS1)和CYP450氧化還原酶的基因表達均發(fā)生變化［24］。

4 腎臟藥物排泄功能的生理節(jié)律性變化及調節(jié)

腎臟在藥物、有毒物質及其代謝產物的清除過程中也發(fā)揮了重要作用，主要通過腎小球濾過、腎小管分泌及腎小管重吸收等途徑完成對上述物質的清除。大鼠尿蛋白含量、腎小球濾過率及腎血漿流量在夜間活動期均高于休息期［25］，另外，動物尿液pH值也可呈現(xiàn)出生理節(jié)律性變化［26］。上述腎臟生理功能的節(jié)律性變化均可影響它對藥物的清除過程。腎臟存在時鐘基因 rPER1、rPER2、rPER3、BMAL1及 DBP，并且呈現(xiàn)時間節(jié)律性表達，它們在20:00的表達量均高于8:00［27］。Na+/H+交換體3在維持機體電解質及酸堿平衡過程中具有重要作用，其mRNA表達呈現(xiàn)節(jié)律性變化并且時鐘蛋白/BMAL1異二聚體調控［28］。Na+對維持胞外液體積及血壓發(fā)揮著關鍵作用，在醛固酮調節(jié)下，通過表皮Na+通道從腎小管液被吸收至胞外，表皮Na+通道的mRNA表達具有明顯的時間節(jié)律性，PER1參與了上述過程的調節(jié)［29］。

5 展望

在腸道、肝臟及腎臟等重要生命器官中，與藥物代謝過程密切相關的轉運體及代謝酶的功能發(fā)揮具有不同程度的時間依賴性。因此，在考察藥物療效及其毒性研究中，除關注劑量-效應關系外，還應考慮給藥時間-效應關系。嚴格控制動物光照時間及程序，合理設計及精確控制動物給藥及采樣時間點對遵守動物生理節(jié)律規(guī)律并消除其對實驗結果的影響具有重要的保障作用。目前，多數(shù)研究是從mRNA水平，依靠基因芯片技術對上述藥物轉運體、代謝酶功能的時間依賴性規(guī)律進行了研究?；蛐酒夹g可以呈現(xiàn)出不同時間條件下組織或者細胞的基因表達譜，可以很方便的篩檢出感興趣基因。但是，藥物轉運體、藥物代謝酶及相關調節(jié)因子大部分是以蛋白質形態(tài)發(fā)揮功能，基因轉錄后及翻譯后的調控使得mRNA與蛋白質表達水平并不能始終一致。因此，應該從蛋白質水平考察它們的時間節(jié)律性及其調節(jié)機制，引入蛋白質組學理論和技術，將會加快本領域的研究進程。肝臟自身生物鐘相關基因已被證實參與了藥物代謝酶時間節(jié)律性表達的調節(jié)，并且肝臟生物鐘調節(jié)需要SCN參與［30］，但SCN是否參與肝臟藥物代謝酶調節(jié)及其機制需要進一步研究。腎臟分布有大量的轉運體，與藥物代謝有關的包括ABC轉運體及溶質轉運體家族，這些轉運體表達是否具有生理節(jié)律性及其調節(jié)機制也需要進一步研究。

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