苯扎貝特通過過氧化物酶體增殖物激活受體α信號途徑對人橫紋肌RD細(xì)胞的毒性作用

趙 艷，樸莉花，吳 坤

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱 150081;2.哈爾濱市阿城區(qū)疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150300)

血脂異常與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是腦卒中、冠心病、心肌梗死和心臟猝死獨立而重要的危險因素，也是導(dǎo)致高血壓和糖尿病的重要危險因素［1］。貝特類降脂藥物作為過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)的配體，能夠有效地降低甘油三酯水平和升高高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)水平，因而在臨床上廣泛應(yīng)用［2－3］。

大規(guī)模臨床試驗結(jié)果顯示，貝特類藥物通常無不良反應(yīng)，但部分患者會出現(xiàn)肝臟和肌肉損傷，表現(xiàn)為血中肌酸激酶(creatine kinase，CK)活性增加、肌無力和肌痛，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肌病和橫紋肌溶解癥等藥物不良反應(yīng)［2，4－5］。本研究旨在觀察苯扎貝特(bezafibrate)對人橫紋肌RD細(xì)胞的毒性作用，探討PPARα配體類降脂藥物影響人骨骼肌細(xì)胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

苯扎貝特購自ICN公司。改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(modified Eagle medium，MEM)購自Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰酶購自Gibco公司。WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Dojindo公司;MK886購自BioMol公司;總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Qiagen公司;實時PCR引物與試劑盒購自Applied Biosystems公司。CO2培養(yǎng)箱(日本 Sanyo公司);超純水儀(法國Millipore公司);相差倒置顯微鏡(日本Olympus公司);酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);PCR儀(美國BioRad公司);ABI 7700實時熒光定量PCR儀(英國Applied Biosystems公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RD細(xì)胞購自美國細(xì)胞資源庫(American Type Culture Collection)。細(xì)胞在含有10%FBS、青霉素100 kU·L－1、鏈霉素 100 mg·L－1的 MEM 培養(yǎng)基中，于37℃含5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，并用0.02%EDTA與0.25%胰酶混合液消化、傳代培養(yǎng)。苯扎貝特溶于二甲亞砜(DMSO)，使用前用MEM培養(yǎng)液稀釋為 10，30，100，300 和 1000 μmol·L－1;MK886 亦溶于 DMSO，終濃度為 1 μmol·L－1。

1.3 WST-1法測定細(xì)胞存活

處于對數(shù)生長期的RD細(xì)胞經(jīng)常規(guī)消化，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔5.0×103個細(xì)胞，加入苯扎貝特0，10，30，100，300 和1000 μmol·L－1，每個劑量組設(shè)3個平行孔和空白孔。實驗結(jié)束前每孔加入新鮮配制的20 μl WST-1，采用450 nm/690 nm雙波長法用酶標(biāo)儀測定吸光度(A)值，實驗重復(fù)3次，并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A實驗組－A空白對照組)/(A對照組－A空白對照組)×100%。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

處于對數(shù)生長期的RD細(xì)胞經(jīng)胰酶/EDTA消化，接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)80%融合后按分組加入藥物進(jìn)行處理，分別為單獨苯扎貝特0，10，30，100，300 和 1000 μmol·L－1作用 24 h;或者相應(yīng)濃度的苯扎貝特 +MK886 1 μmol·L－1作用 24 h組;加入 500 μl RLT緩沖液，渦旋混勻。根據(jù)RNeasy Mini Kit說明書進(jìn)行操作，提取總RNA，用核酸蛋白分析儀測定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按Omniscript RT試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 實時熒光定量 PCR方法檢測 PPARα和PDK4 mRNA表達(dá)水平

采用TaqMan熒光標(biāo)記的PPARα和丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)探針檢測基因表達(dá)情況，以GAPDH基因作為內(nèi)對照。按TaqMan Universal PCR Master Mix說明書配制體系，ABI 7700 PCR儀上95℃變性10 min，反應(yīng)條件為:95℃ 15 s，60℃ 1 min，然后進(jìn)行40個PCR循環(huán)，實驗重復(fù)3次，結(jié)果用循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)方法進(jìn)行分析，以公式2－ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 苯扎貝特對RD細(xì)胞存活的影響

與苯扎貝特0 μmol·L－1組相比，苯扎貝特30 和100 μmol·L－1對 RD 細(xì)胞存活無影響，苯扎貝特 300和 1000 μmol·L－1明顯抑制 RD 的生長，有明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞生長分別被抑制13%和31%(P ＜0.01)。苯扎貝特 1000 μmol·L－1對細(xì)胞生長的抑制作用明顯強于 300 μmol·L－1濃度的作用(P ＜0.01)(表1)。

表1 苯扎貝特對人橫紋肌RD細(xì)胞生長的影響Tab.1 Effects of bezafibrate on human rhabdomyosarcoma RD cell proliferation

2.2 苯扎貝特對PPARα mRNA和PDK4 mRNA表達(dá)的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，苯扎貝特增加PPARα和PDK4基因的表達(dá)水平，呈濃度依賴關(guān)系(圖1A 和圖1B)。苯扎貝特 300 和 1000 μmol·L－1組PPARα mRNA的表達(dá)分別為苯扎貝特0 μmol·L－1組的 2 和 3 倍(P ＜0.05 和 P ＜0.01)。MK886 1 μmol·L－1與苯扎貝特同時作用于 RD 細(xì)胞明顯抑制苯扎貝特上調(diào)PPARα表達(dá)的作用，分別降低47%和43%(P＜0.05)(圖1A)。苯扎貝特10，30，100，300 和 1000 μmol·L－1組顯著增加 PDK4 mRNA 的表達(dá)，分別為苯扎貝特0 μmol·L－1組的 6，24，55，104和 164倍(P＜0.01)。苯扎貝特 +MK886各組PDK4 mRNA表達(dá)顯著高于MK886+苯扎貝特0 μmol·L－1組(P ＜0.01)，但明顯低于單用苯扎貝特同一濃度組，苯扎貝特30，100，300和1000 μmol·L－1與 MK886 合用組分別降低了 44%，60%，69%和63%(P ＜0.05)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，RD細(xì)胞經(jīng)苯扎貝特處理后，細(xì)胞生長明顯受到抑制，表明苯扎貝特對RD細(xì)胞具有一定的毒性。

圖1 實時熒光定量PCR檢測苯扎貝特對RD細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)和丙酮酸脫氫酶激酶4(PDK4)mRNA表達(dá)的影響.藥物作用RD細(xì)胞24 h.±s，n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，與 0 μmol·L－1組比較;#P ＜0.05，與相應(yīng)的苯扎貝特組比較.Fig.1 Effect of bezafibrate on peroxisome proliferatorsactivated receptor α(PPARα)and pyruvate dehydrogenase kinase 4(PDK4)mRNA expression by real-time quantitative PCR in RD cells.

PPAR屬于核受體超家族的一員，對脂類代謝發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其中PPARα在脂肪酸氧化能力強的組織(如骨骼肌)中高表達(dá)，主要促進(jìn)脂肪酸發(fā)生β-氧化，加速體內(nèi)脂類的清除［6－8］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯扎貝特在 10 ～ 100 μmol·L－1對 PPARα mRNA 表達(dá)沒有影響，300 和 1000 μmol·L－1時明顯增加PPARα mRNA的表達(dá)，PPARα拮抗劑MK886明顯抑制苯扎貝特對PPARα的激活作用，說明苯扎貝特引起肌細(xì)胞毒性的過程中PPARα可能發(fā)揮了作用。

碳水化合物在丙酮酸脫氫酶復(fù)合物催化下，通過丙酮酸脫羧形成乙酰輔酶A進(jìn)入線粒體用于氧化，并在肌肉代謝中發(fā)揮重要作用，PDK4可抑制該復(fù)合物的活性［9－10］。本研究結(jié)果顯示，苯扎貝特顯著上調(diào)PDK4基因表達(dá)，該上調(diào)作用可被PPARα拮抗劑MK886明顯抑制。推測苯扎貝特發(fā)揮降脂作用后，脂肪酸利用率加快，體內(nèi)儲存減少，PPARα激活PDK4后抑制糖酵解，使得肌肉蛋白質(zhì)被分解用于提供能量，這可能是苯扎貝特引起肌病甚至橫紋肌溶解癥的作用機制。

綜上所述，苯扎貝特作為PPARα配體對RD細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用，PPARα及其下游基因PDK4發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，但在此過程中PPARα活性是否發(fā)生變化仍需進(jìn)一步探討。

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