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    短刺小克銀漢霉AS 3.153菌株對(duì)安非他酮的代謝轉(zhuǎn)化

    2010-05-14 01:08:26吳艷平何艷艷齊秀蘭
    關(guān)鍵詞:羥基質(zhì)譜產(chǎn)物

    吳艷平,何艷艷,齊秀蘭,徐 威,陳 羽,孫 璐

    (沈陽藥科大學(xué)1.分析化學(xué)教研室,2.微生物學(xué)教研室,3.高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院,遼寧沈陽 110016)

    鹽酸安非他酮(1-(3-氯苯基)-2-[(1,1-甲基乙基)氨基]-1-丙酮鹽酸鹽)(amfepramone)屬氨基酮類抗抑郁藥,具有良好的治療作用和較小的不良反應(yīng),同時(shí)也是全球第一個(gè)非尼古丁類似物的戒煙藥[1],該藥在人和動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑主要包括叔丁基羥基化、苯環(huán)羥基化、羰基還原及進(jìn)一步與葡萄糖醛酸或硫酸結(jié)合[2]。其中叔丁基羥基化安非他酮結(jié)構(gòu)中的羥基會(huì)迅速與羰基成環(huán),形成代謝產(chǎn)物2(metabolite 2,M2),經(jīng)確認(rèn)為嗎啉環(huán)羥基化安非他酮(morpholine-hydroxyamfepramone),這一代謝反應(yīng)在人體中較為少見,具有一定的研究價(jià)值。雖有文獻(xiàn)報(bào)道M2的合成工藝[3],但操作復(fù)雜,副產(chǎn)物較多。小克銀漢霉菌屬中的一些菌株具有與哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素P450同工酶非常類似的代謝酶類,可以進(jìn)行某些與哺乳動(dòng)物相似的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝反應(yīng)[4-5]。本研究從小克銀漢霉菌屬真菌中篩選出4株最佳菌株,并在采用此菌株優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)化條件的同時(shí)探討用其制備M2純品的可能性。

    1 材料與方法

    1.1 菌種和培養(yǎng)基

    短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)、刺孢小克銀漢霉(C.echinulata AS 3.2004)、雅致小克銀漢霉(C.elegans AS 3.156)和雅致小克銀漢霉(C.elegans AS 3.2028)由沈陽藥科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供。

    斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基,成分為:蔗糖1.5 g,瓊脂2.0 g,馬鈴薯20 g 和蒸餾水100 ml。種子和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:葡萄糖 2.0 g,酵母膏 0.5 g,蛋白胨0.5 g,氯化鈉 0.5 g,磷酸氫二鉀 0.5 g 和蒸餾水100 ml,pH調(diào)至 8.0。培養(yǎng)基均于 115℃ 滅菌30 min。

    1.2 藥品和儀器

    安非他酮由沈陽華泰藥物研究有限公司提供,純度>99.8%。液相色譜-多級(jí)質(zhì)譜分析所用試劑均為色譜純,其他試劑均為市售生物化學(xué)試劑和分析純?cè)噭?/p>

    Agilent 1100 SL型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司,美國),KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),LD5-2A低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠),XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司),DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠),JA2002電子天平(上海精天電子儀器有限公司),HH-B 11-80S電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠),MJ-250I霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),銀州牌280型手提式壓力蒸汽消毒器(遼寧省鐵嶺市醫(yī)療器械總廠),TG 328B豪華型超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)和Strata C18-E固相萃取柱(菲羅門公司,美國)。

    1.3 孢子和種子的制備

    將4℃保存的4個(gè)菌株分別接種于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上,置于28℃恒溫培養(yǎng)7 d,得到菌絲生長旺盛、孢子豐富的培養(yǎng)物。用無菌接種環(huán)取一環(huán)含有大量孢子的菌絲體,僅將孢子接入種子瓶(250 ml三角瓶內(nèi)裝50 ml培養(yǎng)基),于28℃振蕩培養(yǎng)24 h,得到種子培養(yǎng)物。

    1.4 安非他酮的微生物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化液的收集

    以5%的量將4種種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)化瓶(100 ml三角瓶內(nèi)裝20 ml培養(yǎng)基),采用上述振蕩培養(yǎng)條件,預(yù)培養(yǎng)24 h后加入安非他酮無菌水溶液,使安非他酮終濃度達(dá)到0.1 g·L-1,轉(zhuǎn)化反應(yīng)持續(xù)168 h。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物上清液,置-20℃冷凍待測(cè)。另設(shè)3組分析對(duì)照樣品:對(duì)照1(轉(zhuǎn)化菌株+培養(yǎng)基),排除轉(zhuǎn)化菌株的自身代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基殘留成分的干擾;對(duì)照2(安非他酮+培養(yǎng)基),考察轉(zhuǎn)化液中是否存在非微生物引起的安非他酮分解產(chǎn)物,同時(shí)確定安非他酮在液相色譜分析時(shí)的出峰時(shí)間;對(duì)照3(純培養(yǎng)基),消除培養(yǎng)基成分的影響。

    1.5 分析樣品制備和液相色譜-質(zhì)譜分析條件

    將冷凍的安非他酮微生物轉(zhuǎn)化樣品及對(duì)照樣品在室溫下融化。用2 ml甲醇和2 ml水依次活化固相萃取小柱,然后取300 μl轉(zhuǎn)化液,與700 μl水混合后通過固相萃取小柱,用1 ml水洗滌,再用1 ml甲醇洗脫,將洗脫液在40℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μl流動(dòng)相溶解,20 μl進(jìn)樣進(jìn)行液相色譜-多級(jí)質(zhì)譜分析。

    色譜柱為 Agilent Extend C18柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸(35∶65∶0.2,V/V/V);流速為0.5 ml·min-1;室溫。質(zhì)譜電噴霧離子化源(ESI),正、負(fù)離子檢測(cè)方式。氮?dú)忪F化氣壓力 30 psi,氮?dú)飧稍餁饬魉?8.0 L·min-1,源電壓4.0 kV,毛細(xì)管溫度325℃,碰撞能量 1.0 V。

    1.6 轉(zhuǎn)化菌株的篩選

    采用液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定經(jīng)4種小克銀漢霉對(duì)安非他酮的轉(zhuǎn)化液中的安非他酮及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,以總產(chǎn)率即菌株產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的峰面積占所有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與原形藥物峰面積之和的百分比來表示菌株的轉(zhuǎn)化能力。

    1.7 安非他酮的微生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

    通過菌株篩選實(shí)驗(yàn),確定采用短刺小克銀漢霉AS 3.153作為模型微生物。為了進(jìn)一步制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M2,優(yōu)化短刺小克銀漢霉AS 3.153對(duì)安非他酮的轉(zhuǎn)化條件。

    1.7.1 轉(zhuǎn)化條件的單因素考察實(shí)驗(yàn)

    底物終濃度分別為 0.025,0.05,0.1 和 0.2 g·L-1,轉(zhuǎn)化時(shí)間分別為72,96,120,144 和168 h,初始 pH 值分別為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 和 8.5的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定最佳轉(zhuǎn)化條件及正交試驗(yàn)的因素和水平。

    1.7.2 轉(zhuǎn)化條件的進(jìn)一步優(yōu)化

    根據(jù)文獻(xiàn)[6],培養(yǎng)基初始pH、底物濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間和微生物4個(gè)因素對(duì)安非他酮轉(zhuǎn)化率有影響。在單因素考察的基礎(chǔ)上,每個(gè)因素又各自選取了3個(gè)水平(表1),忽略各因素間的相互作用,采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)確定最佳轉(zhuǎn)化條件。

    表1 安非他酮優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件的4個(gè)因素及其3個(gè)水平Tab.1 Factors and levels of amfepramone transformation conditions

    表2 安非他酮轉(zhuǎn)化條件考察的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.2 Orthogonal expreiment of amfepramone transformation conditions

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn),各因素間的相互作用可以忽略。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)挑選的4因素和各因素的3水平,采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)化條件。

    2 結(jié)果

    2.1 安非他酮代謝產(chǎn)物的高效液相-多級(jí)質(zhì)譜分析

    安非他酮的總離子流和選擇離子流色譜圖見圖1,安非他酮及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M1,M2和M3的一級(jí)質(zhì)譜圖見圖2,安非他酮及M1,M2和M3的二級(jí)和三級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。結(jié)果顯示,每個(gè)菌株的3組對(duì)照樣品對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和殘留底物的分析檢測(cè)均無干擾。在(+)ESI-MS一級(jí)全掃描質(zhì)譜條件下,安非他酮主要生成質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio,m/z)為240([M+H]+)(圖2A)的準(zhǔn)分子離子。采用電噴霧離子阱質(zhì)譜技術(shù)選擇性地對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,安非他酮主要脫去叔丁基,生成m/z為184的碎片離子(圖3A)。

    以安非他酮底物對(duì)照樣品(對(duì)照2)的總離子流色譜圖(total ion current,TIC)(正離子檢測(cè))為對(duì)照(圖1A1),在短刺小克銀漢霉菌轉(zhuǎn)化樣品的色譜圖中幾乎沒有檢測(cè)到安非他酮的原形藥物(m/z=240),而是發(fā)現(xiàn)了2個(gè)準(zhǔn)分子離子m/z為256([M+H]+)的M1(圖2B)和M2(圖2C)(圖1B1)。根據(jù)藥物代謝的一般規(guī)律,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子比母體藥物大16 u,可能為單羥基化代謝產(chǎn)物。對(duì)M1進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,主要生成碎片離子m/z 200和m/z 182 u(圖3B)。其中碎片離子m/z 200比母離子小56 u,為脫去叔丁基后生成的碎片離子,質(zhì)譜斷裂方式與母體藥物一致,且m/z 200比m/z 184大16 u,表明羥基化位點(diǎn)發(fā)生在安非他酮脫叔丁基后的剩余部分上;碎片離子m/z 182為M1脫叔丁基后進(jìn)一步脫水生成。M1的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]一致,推測(cè)M1為苯環(huán)單羥基化安非他酮。在M2的二級(jí)全掃描質(zhì)譜中,主要生成碎片離子m/z 238(圖3C)和m/z 184(響應(yīng)值約為基峰m/z 238的1%)。其中碎片離子m/z 184與母體藥物脫去叔丁基后的碎片一致,推測(cè)羥基化位點(diǎn)發(fā)生在叔丁基上;碎片離子m/z 238為M2脫水生成。將M2進(jìn)行分離純化,根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合NMR方法(圖略),確證代謝產(chǎn)物M2為嗎啉環(huán)羥基化安非他酮。

    圖1 高效液相色譜-質(zhì)譜總離子流(TIC)和選擇離子監(jiān)測(cè)(EIC)模式下安非他酮的底物的對(duì)照品(A)和經(jīng)短刺小克銀漢霉AS 3.153轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化樣品(B)的色譜圖.1.正離子檢測(cè)方式(+MS),2.負(fù)離子檢測(cè)方式(-MS).Fig.1 Chromatograms of amfepramone substrate control sample(A)and transformed amfepramone sample from C.blakesleana AS 3.153(B)by total ion current(TIC)scan mode and selected ion monitoring(SIM)scan mode.

    圖2 安非他酮(A)及其代謝產(chǎn)物M1(B),M2(C),M3(D)的一級(jí)質(zhì)譜圖.+MS:正離子檢測(cè)方式;-MS:負(fù)離子檢測(cè)方式.Fig.2 Full scan MS of amfepramone(A)and its metabolites M1(B),M2(C)and M3(D).

    圖3 安非他酮(A)及其代謝產(chǎn)物M1(B),M2(C),M3(D)的二級(jí)質(zhì)譜和M3的三級(jí)質(zhì)譜.MS2:二級(jí)質(zhì)譜.MS3:三級(jí)質(zhì)譜.(+)正離子檢測(cè)方式;(-):負(fù)離子檢測(cè)方式.Fig.3Full scan MS2of amfepramone(A),M1(B),M2(C),M3(D)and MS3of M3(E).

    以安非他酮底物對(duì)照品(對(duì)照2)的TIC色譜圖(負(fù)離子檢測(cè))為對(duì)照(圖1A2),在短刺小克銀漢霉菌轉(zhuǎn)化樣品的色譜圖中還檢測(cè)到準(zhǔn)分子離子m/z 334([M-H]-)(圖2D)的代謝產(chǎn)物M3(圖1B2)。對(duì)其進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,主要生成減少了80 u的碎片離子m/z 254(圖3D),而 m/z 254為單羥基化安非他酮的負(fù)離子掃描結(jié)果,推測(cè)M3為單羥基化安非他酮的硫酸結(jié)合物。對(duì)m/z 254進(jìn)行三級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,主要生成碎片離子m/z 154和m/z 182(圖3E),其中m/z 154為m/z 254脫去叔丁胺基乙基后生成的碎片離子,m/z 182為脫去叔丁胺基后生成的碎片離子,推測(cè)羥基化位點(diǎn)發(fā)生在苯環(huán)上。而且M3的質(zhì)譜斷裂方式與文獻(xiàn)[2]一致,可推測(cè)代謝產(chǎn)物M3為苯環(huán)單羥基化安非他酮的硫酸結(jié)合物。綜合以上結(jié)果,短刺小克銀漢霉AS 3.153對(duì)藥物安非他酮的代謝途徑見圖4。

    2.2 安非他酮轉(zhuǎn)化菌株的篩選

    短刺小克銀漢霉AS 3.153,刺孢小克銀漢霉AS 3.2004,雅致小克銀漢霉AS 3.156和雅致小克銀漢霉AS 3.2028 4種小克銀漢霉菌對(duì)安非他酮均具有一定的轉(zhuǎn)化能力,總產(chǎn)率分別為88.0%,78.3%,50.2%和42.7%。其中短刺小克銀漢霉AS 3.153的總轉(zhuǎn)化率最高,生成代謝產(chǎn)物M2的比例也最高,故將其作為安非他酮藥物代謝研究的體外模型作進(jìn)一步研究。

    2.3 短刺小克銀漢霉AS 3.153對(duì)安非他酮的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

    2.3.1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)安非他酮轉(zhuǎn)化的影響

    微生物轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是進(jìn)行酶促反應(yīng),pH值作為影響藥物代謝酶活性的因素同樣也影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行程度。轉(zhuǎn)化體系中環(huán)境的pH在影響酶分子解離狀態(tài)的同時(shí)也影響了底物的解離狀態(tài),通常分子狀態(tài)的底物更容易透過細(xì)胞膜進(jìn)入菌體發(fā)生轉(zhuǎn)化;pH過高或過低均影響酶蛋白的構(gòu)象,甚至使其喪失活性。培養(yǎng)基在初始 pH 值為 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0和8.5 時(shí),總產(chǎn)率分別為 17.4%,60.7%,77.1%,81.5%,88.0%和 85.0%,其中 pH 8.0 時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值88%。

    2.3.2 底物濃度對(duì)安非他酮轉(zhuǎn)化的影響

    安非他酮濃度對(duì)短刺小克銀漢霉AS 3.153轉(zhuǎn)化安非他酮的產(chǎn)率影響較大。安非他酮終濃度為0.025,0.05,0.1 和 0.2 g·L-1時(shí)的短刺小克銀漢霉對(duì)安非他酮的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率分別為64.1%,67.5%,87.0%和 73.7%;其中當(dāng)安非他酮濃度為 0.1 g·L-1時(shí),代謝物M2產(chǎn)率達(dá)到最大值87%。

    2.3.3 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)安非他酮轉(zhuǎn)化的影響

    微生物轉(zhuǎn)化安非他酮的主要產(chǎn)物M2在不同時(shí)間的累積量差異較大。轉(zhuǎn)化時(shí)間為168 h時(shí),安非他酮幾乎完全被轉(zhuǎn)化,M2的轉(zhuǎn)化率最大。

    圖4 安非他酮在微生物中的化學(xué)轉(zhuǎn)化過程.M1,M2,M3和M4為安非他酮的代謝產(chǎn)物.M4為本實(shí)驗(yàn)未直接檢測(cè)的代謝產(chǎn)物.Fig.4 Metabolic pathways of amfepramone in microorganism.

    2.3.4 正交實(shí)驗(yàn)對(duì)安非他酮的轉(zhuǎn)化條件的進(jìn)一步優(yōu)化

    忽略各因素間的相互作用,正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表3所示。從表中可以看出,培養(yǎng)基初始pH因素中為最大,即培養(yǎng)基初始pH因素中3水平的平均轉(zhuǎn)化率最高。同理來選擇底物濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間和微生物3因素的最優(yōu)水平,得安非他酮的最佳轉(zhuǎn)化條件為采用短刺小克銀漢霉AS 3.153作為模型微生物,培養(yǎng)基初始 pH 8.5,底物濃度 0.1 g·L-1和轉(zhuǎn)化時(shí)間為168 h。

    3 討論

    自提出哺乳類動(dòng)物藥物代謝的微生物模型概念以來,微生物轉(zhuǎn)化作為一種平行于人體藥物代謝的手段而發(fā)展起來,為現(xiàn)代藥理學(xué)與毒理學(xué)的藥物代謝研究提供了一些有用的方法。

    在文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)篩選了小克銀漢霉菌屬的4種菌株,確定以短刺小克銀漢霉AS 3.153作為模型微生物。短刺小克銀漢霉AS 3.153主要將安非他酮轉(zhuǎn)化為苯環(huán)羥基化安非他酮(M1)、嗎啉環(huán)羥基化安非他酮(M2)和苯環(huán)羥基化安非他酮的硫酸結(jié)合物(M3),總轉(zhuǎn)化率達(dá)到88%。本研究檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物與文獻(xiàn)中報(bào)道的人體內(nèi)安非他酮代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相同,可認(rèn)為該菌株是研究安非他酮代謝反應(yīng)的適宜體外模型。但安非他酮在人體內(nèi)的Ⅱ相代謝產(chǎn)物除了硫酸結(jié)合物外,還有葡萄糖醛酸結(jié)合物。而在微生物模型中只找到硫酸結(jié)合物,說明微生物轉(zhuǎn)化和哺乳動(dòng)物代謝之間仍存在著一定的種屬差異,造成這種差異的原因可能是用于安非他酮代謝研究的短刺小克銀漢霉AS 3.153體內(nèi)缺少與葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的代謝酶或輔助因子。

    表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的安非他酮轉(zhuǎn)化條件Tab.3 Results of orthogonal experiment of amfepramone transformation conditions

    為了制備代謝產(chǎn)物M2,本實(shí)驗(yàn)采用單因素考察實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)兩種方法來確定安非他酮微生物轉(zhuǎn)化的最佳條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,除培養(yǎng)基的初始pH有微小差別外,其他最佳條件均一致。

    與哺乳動(dòng)物生物轉(zhuǎn)化相比,微生物轉(zhuǎn)化具有很強(qiáng)的專一性,能夠用來進(jìn)行特定的藥物代謝反應(yīng)[8],此外,微生物轉(zhuǎn)化法還具有周期短、成本低[9]、易調(diào)節(jié)和易放大等特點(diǎn)[10-11]。本研究篩選出的短刺小克銀漢霉AS 3.153可以作為研究人用藥物代謝的體外模型,同時(shí),還可以采用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件制備M2純品。

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