閃式提取法提取丹參中有效成分的研究

于 敏， 韓德強(qiáng)

(佳木斯大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯154007)

丹參系唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效。丹參主要有效成分為水溶性酚酸類(丹參素、原兒茶醛及丹酚酸)、脂溶性二萜醌類(丹參酮和丹參醌)，傳統(tǒng)的丹參有效成分提取工藝，如水煎法、水醇法、乙醇回流法、超聲波法。本實(shí)驗(yàn)以丹參酮ⅡA和原兒茶醛為指標(biāo)成分，通過閃式提取法對(duì)丹參進(jìn)行提取，采用正交試驗(yàn)法對(duì)影響丹參提取工藝的主要因素進(jìn)行了考察，并采用高效液相色譜法對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，確定出最佳提取工藝，為丹參制劑的前處理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 110型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，JHBC－50S閃式提取器(北京市金鼐科技發(fā)展有限公司);UV/Vis－WC1型褶合光譜儀(上海玉田分析儀器公司);R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110766－200417);原兒茶醛對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110810－200506);丹參為市售(佳木斯市藥材公司);鑒定為唇形科植物丹參(Salviamiltiorrhiza Bge.)的干燥根及根莖;色譜純甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)［2～4］及單因素實(shí)驗(yàn)，選取影響提取物收率的浸泡時(shí)間(A)，提取時(shí)間(B)，提取電壓(C)為考察因素，以丹參酮ⅡA和原兒茶醛的含量為考察指標(biāo)，確定因素水平如表1。

2.2 試驗(yàn)方法

稱取丹參藥材粗粉9份，各25 g，按L9(34)正交試驗(yàn)，先用15倍量95%乙醇浸泡3 h，閃式提取后，再用15倍量水浸泡1 h進(jìn)行提取，提取液過濾，合并，濃縮，定容至100 mL。

表1 因素與水平表

2.3 丹參酮ⅡA含量測(cè)定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇－水(83 ∶17)，流速:1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm。

圖1 丹參酮ⅡA對(duì)照品的HPLC圖

圖2 丹參酮ⅡA樣品的HPLC圖

2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取正交試驗(yàn)溶液各10 mL，加95%乙醇定容至100 mL，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.3.3 對(duì)照品溶液制備 取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加95%乙醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取對(duì)照品溶液(41.00 μg/mL)5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，以對(duì)照品進(jìn)樣量對(duì)峰面積作圖，計(jì)算得回歸方程:Y=4 723.8X－263.97，r=0.999 6，說明丹參酮ⅡA對(duì)照品在0.205～1.025 μg范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液15 μL，進(jìn)樣按含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5次峰面積，結(jié)果表明:精密度RSD=1.71%，精密度較高，說明本方法用于測(cè)定丹參酮ⅡA比較穩(wěn)定。

2.3.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取第5組樣品，分別在0，2，6，8，10 h進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為0.91%，說明本溶液在10 h內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 吸取一定量已知含量的提取液，加入一定量丹參酮ⅡA對(duì)照品，制備成5份樣品，按前述條件進(jìn)行含量測(cè)定，平均加樣回收率為100.8%，RSD為1.01%，回收率較高，方法可靠。

2.3.8 測(cè)定法 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積A，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到進(jìn)樣量。則含量計(jì)算方法如下:

結(jié)果見表2，方差分析見表3。

2.4 原兒茶醛含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇－水－冰醋酸(18 ∶89 ∶1)，流速:1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。

圖3 原兒茶醛對(duì)照品HPLC圖

圖4 原兒茶醛樣品HPLC圖

2.4.2 供試品溶液的制備 精密吸取正交試驗(yàn)溶液各10 mL，加50%乙醇定容至 50 mL，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.4.3 對(duì)照品溶液制備 取原兒茶醛對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，加水制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液5、10、15、20、25 μL，分別注入液相色譜儀，以對(duì)照品進(jìn)樣量對(duì)吸收峰面積作圖，計(jì)算得回歸方程:Y=6 629.1x－148.19，r=0.999 7，表明原兒茶醛對(duì)照品在0.2～1.0 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液15 μL，進(jìn)樣按含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5次峰面積，結(jié)果表明:精密度RSD=1.19%，精密度較高，說明本方法用于測(cè)定原兒茶醛比較穩(wěn)定。

2.4.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取第5組樣品，分別在0，2，6，8，10 h進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣20 μL，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為0.75%，說明本溶液在10 h內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 吸取一定量已知含量的提取液，加入一定量原兒茶醛對(duì)照品，制備成5份樣品，按前述條件進(jìn)行含量測(cè)定，平均加樣回收率為101.4%，RSD為1.05%，回收率較高，方法可靠。

2.4.8 測(cè)定法 分別精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積A，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到進(jìn)樣量Mμg。則含量計(jì)算方法如下:

含量測(cè)定結(jié)果見表2，方差分析見表4。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2直觀分析，丹參酮ⅡA的極差RB＞RC＞RA，即對(duì)提取影響大小順序?yàn)锽＞C＞A，最佳工藝為A3B3C2;原兒茶醛的極差為RC＞RB＞RA，對(duì)提取效果的影響順序?yàn)镃＞B＞A，最佳工藝為A1B3C3。綜合直觀分析以及方差分析結(jié)果，確定最佳的提取工藝為A3B3C2，即浸泡1.5 h，提取時(shí)間60 s，電壓 120 V。

表3 丹參酮ⅡA方差分析

表4 原兒茶醛方差分析

2.5 閃式提取與其他提取方法的比較

取5份丹參藥材，各50 g，分別用500 mL不同的溶劑浸泡3 h后提取:①水和95%乙醇各加熱提取1.5 h;②95%乙醇和水各加熱提取1.5 h;③95%乙醇、50%乙醇和水各加熱提取1 h;④70%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h;⑤閃式提取。各合并提取液，過濾，減壓濃縮，定容。分別按2.3項(xiàng)和2.4項(xiàng)的方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見表5。

表5 不同提取方法對(duì)丹參酮ⅡA和原兒茶醛含量的比較

從上表中可以看出:閃式提取法比其它的一些煎煮法具有更高的提取率。

3 討論

由方法學(xué)研究表明，用HPLC法測(cè)定丹參中丹參酮ⅡA和原兒茶醛的準(zhǔn)確度和靈敏度較高，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，適用于本文的研究。

丹參作為臨床常用中藥，提取工藝研究具有較大的實(shí)用價(jià)值。丹參中以原兒茶醛為代表的丹酚酸是丹參的水溶性成分中主要的有效成分，其性質(zhì)不穩(wěn)定，易于氧化。如果用煎煮法提取，則提取時(shí)間和溫度等影響因素都要加以考慮。閃式提取法則無需考慮這些因素的影響，同時(shí)還具有的快速、高效、節(jié)省能源和試劑、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［5］，是回流提取法、超聲提取法所無法比擬的。丹參中脂溶性成分中丹參酮ⅡA含量較大，丹參酮ⅡA的提取效果也直接影響治療效果，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，閃式提取法對(duì)丹參中的脂溶性成分以及水溶性成分均有較高的提取效果，是一種較佳的丹參提取方法。

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