丹皮酚對AD模型鼠腦組織神經(jīng)細胞與膠質(zhì)細胞活性的影響

周 軍， 周 麗， 曾慶仁， 侯德仁， 陳 坤， 田 怡， 萬 順

(1.中南大學湘雅三醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，2.湘雅醫(yī)學院細胞與分子生物學實驗中心，3.湘雅三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南長沙410013)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理特征為腦組織萎縮、老年斑和大量的β－淀粉樣蛋白(β － amyloid protein，Aβ)沉積［1，2］。目前仍缺乏特效及安全的治療方法，因此開展對AD發(fā)病機制研究和有效的篩選防治AD的藥物就成為醫(yī)學界研究的重點。AD的發(fā)病主要學說為凝聚態(tài)Aβ在腦實質(zhì)的沉積，啟動病理級聯(lián)，導致神經(jīng)細胞纖維纏結(jié)形成，神經(jīng)元丟失和癡呆表現(xiàn)［3］。另外與機體氧自由基產(chǎn)生增加、清除能力下降，伴有一個緩慢的炎癥病理改變過程等因素有關(guān)［4］。同時神經(jīng)膠質(zhì)細胞在上述因素作用下活化分泌大量細胞因子，激活補體，啟動免疫反應，在AD的病變中也起重要作用。

丹皮酚(Pae)是從毛莨科植物牡丹根皮和蘿摩科植物徐長卿干燥根或全草中提取出來的一種活性成分.對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和消炎抗氧化及保護心腦血管等廣泛的藥理活性，臨床上廣泛用于治療炎癥，增強免疫力、鎮(zhèn)痛和抗心律失常等心腦血管疾病［5］。

目前，丹皮酚作用及其機制的研究不斷拓展和深入，由于其分子量小，極易透過細胞膜，作用類似于通道的阻滯劑，還具有抗自由基的作用，故有可能成為一種很好的用于研究治療AD疾病的藥物。本實驗在觀察Aβ所引起神經(jīng)毒作用的同時，也探索了丹皮酚在Aβ沉積在腦組織后所發(fā)揮的作用以及干預后的腦組織GFAP和S100β表達水平的變化，為臨床應用丹皮酚治療AD疾病尋找了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 纖維型 Aβ1－42的制備

取 1 mg Aβ1－42(美國 Sigma公司)溶于 500 μL 注射用生理鹽水中，置于37℃恒溫箱中孵育時用微細磁力攪拌子充分攪拌持續(xù)1周，使其成為聚集狀態(tài)的纖維型Aβ1－42，置于4℃冰箱中備用。

1.2 動物分組及模型制備

成年SD♂性大鼠24只，體重180～220 g(由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心提供)，其中隨機取16只建立AD模型，8只作為正常對照組。建模方法:將SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)麻醉后置于腦立體定位儀上，切開皮膚，找到前囪所在位置，參考大鼠圖譜確定前囪后3.0 mm，中線旁2.0 mm為海馬的所在的體表投影位置，以牙科鉆鉆開一骨窗，將微量注射器固定在立體定位儀上，進針約2.8 mm，緩慢均勻注入纖維型 Aβ1－42溶液10 μg/5 μL，5 min 注射完畢，留針5 min，然后緩慢撤針，術(shù)后縫合皮膚。對照組按照模型制備的全過程在腦內(nèi)注射生理鹽水5 μL。建模成功后隨機分為模型組和Pae用藥組，Pae用藥組用丹皮酚0.5 mg/(kg/d)(寧波天真制藥有限公司生產(chǎn))腹腔注射，持續(xù)40 d。模型組與正常組腹腔內(nèi)注射同容積的生理鹽水并平行給予常規(guī)飲食及正?；顒?。

1.3 腦組織切片的制備

模型建立與干預治療40 d后，將對照組、Pae組和模型組三組大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)深深麻醉，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注0.01 mol/L PBS，待大鼠的肝臟顏色變淺，然后改以新鮮配制的4%多聚甲醛灌注，流速約為10 mL/min，并取腦組織置于4%多聚甲醛溶液中冰箱后固定過夜，次日用0.01M PBS反復浸洗，最后將腦組織梯度酒精脫水，透明，石蠟包埋，冠狀切片(厚約5 μm)備用。

1.4 免疫組織化學主要試劑和實驗方法

脫蠟切片入PBS緩沖液，在抗原修復液(美國Vector，H－3300)80°C存放20 min，待自然冷卻后，緩沖液清洗2次，再入3%H2O2室溫下5 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清中1 h，以減少組織非特異性反應。實驗中所用抗體6E10購于美國Covance公司(SIG－39340，1∶1000);NeuN 購于 Chemicon 公司(MAB－377，1 ∶1000);GFAP購于DAKO公司(Z0334 1∶1000)，S100β購于 Sigma，(S2657，1∶100)。切片分別在1%小牛血清與0.1%Triton和上述抗體的混合液中4°C冰箱孵育過夜，次日經(jīng)緩沖液洗滌3次后，加相應二抗(1∶400)溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結(jié)合(ABC)試劑盒配置的混合液中再孵育1 h。底物呈色反應采用DAB試劑盒。所有二抗、ABC和DAB試劑盒均購自美國vector公司。呈色反應后，切片經(jīng)逐級脫水并用加拿大中性樹膠封片。

1.5 Western印跡法檢測大鼠腦組織GFAP的表達

0.01 MPBS經(jīng)左心室灌注以去除血細胞干擾，然后取腦組織分別置于預冷的蛋白質(zhì)抽提緩沖液(20 mmol/L Tris－Cl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，1%Triton X－100，10%蛋白酶抑制劑混合物，1%磷酸酶抑制劑混合物)中，充分勻漿后，4℃12 000 g離心15 min，去除細胞碎片，吸取上清液，即為腦組織總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度后，立即用于蛋白質(zhì)印跡分析。每個樣本采用20 μg蛋白質(zhì)在10%SDS－PAGE凝膠中電泳分離，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，印跡膜在含5%BSA的TBS緩沖液中封閉1 h，在抗 GFAP(DAKO 1∶1000)溶液中4℃孵育過夜;TBST漂洗膜3次，每次10 min;在HRP標記的二抗溶液中室溫孵育2 h，TBST漂洗膜3次，每次10 min;上述處理后的PVDF膜通過化學發(fā)光電泳圖像處理系統(tǒng)ECL檢測顯色獲得Western印跡反應圖譜。最后以GAPDH(Chemicon 1∶300)抗體做內(nèi)參照。GFAP和GAPDH片段的條帶光密度比值為相對值分別進行比較。

1.6 動物行為學分析

大鼠的學習記憶能力通過電迷宮箱進行測試，將各組大鼠分別放入三等份輻射式Y(jié)型迷宮箱中適應3～5 min后，給予適當電擊，至其等長的3臂均探索進入為止，觀察動物學會逃離電擊區(qū)而進入安全區(qū)的反應能力，記錄每個動物在造模前和造模后正確逃避反應被電擊的次數(shù)。

1.7 圖象采集及統(tǒng)計學分析

在日本產(chǎn)Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察結(jié)果，并用Nikon DS高分辨率數(shù)碼像機經(jīng)NIS－Elements AR 3.0軟件拍照。對腦組織切片均通過拍照收集皮質(zhì)和海馬切面圖像。結(jié)果分析，采用Ver.3.00程序軟件作圖像數(shù)字采集及半定量分析(以著色面積占組織切片總面積的比例確定為標志物免疫組化的陽性數(shù)值。)結(jié)果評估采用單一方差分析，Excel軟件統(tǒng)計制表。

2 結(jié)果

2.1 β淀粉樣蛋白在模型組和Pae組的腦組織的表達

6E10(Aβ1－16)抗體標記腦組織的溶解或聚集狀態(tài)β淀粉樣蛋白。顯微鏡下觀察在正常對照組未發(fā)現(xiàn)β淀粉樣蛋白的沉積，而模型組和Pae組可見海馬中央以及皮質(zhì)中線旁Aβ注射區(qū)可見有大小不等分布不均的6E10抗體陽性反應顆粒表達，兩組比較沒有明顯的差異(P＞0.05)(圖1)。

圖1 β淀粉樣蛋白在模型組和Pae組的腦組織表達

2.2 丹皮酚對β淀粉樣蛋白的神經(jīng)細胞毒性影響

神經(jīng)細胞特異性標記抗體NeuN染色顯示，在模型組和Pae組的Aβ注射的腦組織皮質(zhì)區(qū)和海馬CA3區(qū)可見神經(jīng)細胞大小不一，部分神經(jīng)細胞萎縮變形，神經(jīng)細胞帶受損，細胞數(shù)量減少。Pae組病變程度較輕，對照組未發(fā)現(xiàn)上述改變(P＜0.05)(圖2)。

圖2 對β淀粉樣蛋白的神經(jīng)細胞毒性影響(×400)

2.3 各組大鼠腦組織S100β和GFAP蛋白的表達

S100β蛋白和GFAP在各組大鼠腦組織均有表達，正常對照組的S100β陽性反應細胞數(shù)量較少，細胞染色較淺，Pae和模型組的陽性反應細胞增多，染色反應增強，海馬區(qū)和皮質(zhì)部位均有明顯的表達，兩組反應與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3)。

圖3 對大鼠腦組織S-100β的蛋白的表達

GFAP在對照組的陽性反應弱，細胞小，模型組反應增強，細胞體積增大，腦組織海馬和皮質(zhì)部位表達部位廣泛，Pae組GFAP比對照組反應深，但明顯比模型組減弱，Western Blot定量與免疫組織化學方法檢測結(jié)果一致。(圖4)。

圖4 對大鼠腦組織GFAP蛋白的表達

2.4 三組大鼠海馬和皮質(zhì)中6E10、NeuN和S100β陽性反應半定量統(tǒng)計 見表1。

表1 大鼠海馬和皮質(zhì)中6E10、NeuN和S100β陽性反應半定量統(tǒng)計

2.5 動物行為學分析

學習記憶強、主動逃避反應較敏感的大鼠電擊次數(shù)較少，表明大鼠已經(jīng)形成了正確反應率。反應過于遲鈍的大鼠電擊次數(shù)增多，造模前大鼠主動逃避反應較敏感的大鼠電擊次數(shù)無明顯差異，造模后模型組大鼠反應較遲鈍，電擊次數(shù)增多，而Pae組大鼠主動逃避反應較敏感，電擊次數(shù)減少(P＜0.05)。

圖5 造模前后各組動物主動逃避反應的電擊次數(shù)比較

3 討論

目前認為Aβ的過量產(chǎn)生是AD病理的重要誘發(fā)因素之一［6］，已知腦內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)毒作用的 Aβ 主要是 Aβ1－40和Aβ1－42。雖然實驗用β淀粉樣蛋白是人工合成，但不少研究證明它幾乎和內(nèi)生性的Aβ1－42有同等毒性作用，以聚集狀態(tài)的β淀粉樣蛋白誘導的病變與AD的病理改變十分相似［7，8］。表現(xiàn)在神經(jīng)元退行性病變和 NFT中雙螺旋絲(PHF)的形成，激活膠質(zhì)細胞誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應，以及升高胞內(nèi)Ca2+，使神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等。

另一主要表達在星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的S100β是生理狀態(tài)下神經(jīng)元發(fā)育和軸突生長中發(fā)揮重要的作用蛋白之一，近年來臨床病理分析卻發(fā)現(xiàn)S100β隨年齡有上升趨勢，AD患者的 S100β含量遠高于正常老年組［9］。S100β蛋白對細胞功能的調(diào)節(jié)作用依賴于濃度水平:低濃度有神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用，高濃度S100β具有神經(jīng)毒作用，能升高神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度，誘發(fā)神經(jīng)元變性、神經(jīng)細胞凋亡或壞死。因此，S100β蛋白的過度表達多通常作為神經(jīng)退化性疾病的一個標志［10，11］。

本實驗通過以聚集狀態(tài)的β淀粉樣蛋白進行大鼠背側(cè)細胞帶微量注射，用免疫組織化學的方法以6E10抗體反應證實，纖維型Aβ以不溶解狀態(tài)成大分子而不被吸收，并持續(xù)性的保留在腦組織內(nèi)，導致神經(jīng)毒性使腦組織神經(jīng)元退行性變，注射區(qū)可見Aβ沉積，說明模型是成功的。注射區(qū)神經(jīng)細胞大小不一，有的呈萎縮狀態(tài)。皮質(zhì)局部有些神經(jīng)細胞死亡消失，膠質(zhì)細胞浸潤，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞有局部缺損，CA3的部位更明顯，神經(jīng)細胞呈現(xiàn)不同形態(tài)學變化，使細胞帶受損，同時神經(jīng)細胞數(shù)量減少，膠質(zhì)細胞增多。研究還發(fā)現(xiàn)，外源性給予的 Aβ1－42損傷神經(jīng)元后，并導致腦組織GFAP 和 S100β 蛋白含量增加［12］。

本實驗觀察，AD模型鼠經(jīng)丹皮酚干預治療后，大大減輕了神經(jīng)元損傷和減少了GFAP和S100β的陽性反應。其機理可能是通過抑制GFAP和S100β的過度表達，減少炎癥因子的產(chǎn)生以及細胞凋亡和損傷，提高了細胞清除氧自由基的能力，維護細胞膜的電解質(zhì)穩(wěn)定，達到抗氧化作用，從而對神經(jīng)細胞起到保護作用，進而也明顯改善了動物的學習記憶功能。因此，補充丹皮酚可改善由Aβ誘導的神經(jīng)毒作用。以上研究有助于拓寬中藥治療老年癡呆癥的認識，為中藥治療老年癡呆癥的臨床應用提供一些新的研究資料。

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