白花丹參藥材HPLC指紋圖譜研究

王福剛， 高允生， 齊永秀， 劉 斌， 王 偉

(1.泰山醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東泰安271016;2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京100102)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，丹參具有增加冠狀動脈血流量、調(diào)節(jié)血脂、抑制血栓形成和改善微循環(huán)等作用［1－2］。白花丹參Salvia miltiorrhiza f.Alba是丹參的變型，它主要分布在山東章丘、萊蕪等地的山區(qū)地帶。白花丹參除具有丹參的作用和用途外，對治療血栓閉塞性脈管炎具有獨(dú)特療效，臨床應(yīng)用前景十分廣闊［3］。近年來關(guān)于白花丹參化學(xué)、藥理等方面的研究很多，為進(jìn)一步綜合開發(fā)利用白花丹參，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對白花丹參藥材指紋圖譜進(jìn)行了研究，可為其鑒別、質(zhì)量評價以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀，2996 DAD檢測器;Sartorious BT 25S型1/100000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ－500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹參酮ⅡA(批號:110766－200417)、丹酚酸 B(批號:111562－200504)、丹參素鈉 (批號:110855－200405)、丹參酮Ⅰ(批號:0867－200502)均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇(Sigma公司，色譜純);純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司出品);其他試劑均為分析純。

1.3 供試藥材 白花丹參藥材:其中S1、S3、S4于2006年10月采自山東泰安，S2、S5、S8于2006年11月采自山東萊蕪，S6、S7、S9、S10于2007年10月采自泰安，經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)教研室高紅莉副教授鑒定為唇形科植物白花丹參Salvia miltiorrhiza flalba.Alba的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);采用梯度洗脫;流動相:甲醇(A)－0.1%三氟乙酸水溶液(B)，洗脫劑A在0～5 min為10%，在5～15 min由10%增至40%，在15～50 min由40%增至70%，在50～70 min由70%增至100%，在70～80 min為100%。流速:1.0 mL/min;檢測波長:270 nm;分析時間:75 min。

2.2 供試品溶液的制備 取白花丹參藥材10 g，萬能高速粉碎機(jī)粉碎，均過40目篩。取粉末約1 g，精密稱定，置具有冷凝回流裝置的圓底燒瓶中，精密加入50 mL水，稱定重量，煎煮30 min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失重量。再向燒瓶中精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定重量，用50%的甲醇補(bǔ)足減失的重量，6 000 r/min離心10 min，取上層溶液過0.45 μm微孔濾膜，用于HPLC進(jìn)樣分析。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品適量，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取供試液，連續(xù)進(jìn)樣5次，選擇各共有峰進(jìn)行比較，結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間 RSD＜1.35%，相對峰面積RSD＜2.03%，表明進(jìn)樣的精密度良好。

2.4.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批白花丹參藥材5份，按2.2項(xiàng)方法平行制備供試液，進(jìn)行測定。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD＜1.82%，相對峰面積RSD＜2.90%。表明其重現(xiàn)性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批白花丹參藥材，分別于制備后 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間RSD＜1.43%，相對峰面積RSD＜2.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及技術(shù)參數(shù)

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有指紋峰的標(biāo)定 按照2.1項(xiàng)方法操作，制備10批白花丹參供試液，通過比較10批供試品HPLC色譜圖的檢測結(jié)果，選定其中14個共有的色譜峰為共有指紋峰，建立白花丹參藥材的HPLC色譜指紋圖譜，圖1。經(jīng)對照品定性，1號色譜峰鑒定為丹參素鈉，5號色譜峰為丹酚酸B，11號色譜峰為丹參酮Ⅰ，14號色譜峰為丹參酮ⅡA，見圖2。其中丹酚酸B峰面積約占總峰面積的15%，比較穩(wěn)定，因此選其為參照峰，標(biāo)為S。樣品S1至S10色譜圖出峰總數(shù)依次為 36、38、27、37、38、32、37、23、29、35，共有峰面積占總峰面積的比值依次為91.41%、90.43%、96.74%、91.32%、90.83%、91.21%、90.59%、94.24%、92.27%、90.56%。

圖1 白花丹參供試品HPLC圖譜

2.5.2 共有峰的相對保留時間及相對峰面積 將各色譜峰保留時間與同一圖譜中丹酚酸B的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間;將各色譜峰峰面積與同一圖譜中丹酚酸B的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對峰面積。10批樣品中各共有峰相對保留時間見表1，各共有峰相對峰面積見表2。由表1、2可知，10批樣品基本均一、穩(wěn)定。

表1 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對峰面積

圖2 對照品HPLC圖譜

2.6 指紋圖譜相似度計算 將10批白花丹參藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度軟件2004A，計算均值相似度，結(jié)果 10批樣品相似度分別為 0.997，0.998，0.980，0.998，0.987，0.996，0.997，0.988，0.998，0.968。結(jié)果見圖3。

圖3 10批白花丹參指紋圖譜

3 討論

3.1 提取方法的選擇 通過對提取方式(超聲、熱提取)的考察，發(fā)現(xiàn)采用超聲與熱回流提取相結(jié)合的提取方式，樣品色譜圖的譜峰信號較多［4］。對不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、75%甲醇、水、先水回流后50%甲醇超聲)考察，結(jié)果表明先水回流后50%甲醇超聲色譜圖信息量最多，成分含量最高。對不同流提取時間(30、45、60 min)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)水熱回流30 min，成分?jǐn)?shù)量及含量最高，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，提取時間過長，導(dǎo)致丹參酮類成分減少。故供試品溶液的制備方法確定為以水回流提取30 min，后50%甲醇超聲30 min。

3.2 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇－水系統(tǒng)，甲醇－0.1%冰醋酸系統(tǒng)，甲醇－0.1%三氟乙酸水溶液系統(tǒng)，乙腈－0.1%三氟乙酸水溶液系統(tǒng)。由各色譜圖比較得，甲醇－0.1%三氟乙酸溶液系統(tǒng)出峰峰形較好，基線平穩(wěn)，故選擇甲醇－0.1%三氟乙酸溶液洗脫分離。

在選定的色譜條件下，以DAD檢測器得到的三維圖譜在不同波長下切割，得到270 nm條件下出峰最多，峰形較好，特征性較強(qiáng)，峰的分離度較好，基線也較平穩(wěn)，故選擇270 nm作為檢測波長。

3.3 參照峰的選擇 本品主要含有脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸等成分，本文確定了丹參酮IIA(14號峰)、丹參酮I(11號峰)、丹酚酸B(5號峰)、丹參素鈉(1號峰)的色譜峰位置，經(jīng)HPLC圖譜比較，丹酚酸B峰較大，為丹參的主要成分之一，且中國藥典2005年版一部丹參項(xiàng)下采用其含量為質(zhì)量控制指標(biāo)，故選擇丹酚酸B為參照峰。

3.4 指紋圖譜的評價 對采自山東泰安、萊蕪市的10批白花丹參藥材進(jìn)行了指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)收集來的不同產(chǎn)地白花丹參指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，相似度計算結(jié)果表明，10批樣品指紋圖譜相似度均在90%以上。不同批次的白花丹參藥材指紋圖譜的相對保留時間也有相當(dāng)好的相似性。但是，比較不同產(chǎn)區(qū)藥材各共有峰相對保留面積有所差別，可能因?yàn)樗幉纳a(chǎn)過程中受到土壤、氣候等因素、環(huán)境因素及采收加工過程中諸多因素的影響。

色譜指紋圖譜是在研究中藥指控和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過程中誕生的一種分析技術(shù)，由于色譜指紋圖譜可以提供大量的信息，而且還能提供各組分的相對含量來進(jìn)行量的描述，所以它可以為中醫(yī)藥的研究提供良好的分析數(shù)據(jù)［5］。本實(shí)驗(yàn)采用RP－HPLC方法，建立了白花丹參藥材的指紋圖譜。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為白花丹參藥材質(zhì)量分析、評價與控制提供依據(jù)。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:52－53.

［2］關(guān) 昕，吳立軍，解黎雯.丹參現(xiàn)代研究概況［J］.實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2005(7):445－446.

［3］李允堯，趙華英，陳滬寧，等.山東省白花丹參的植物資源［J］.中藥材，2000，23(2):69－70.

［4］劉 洋，石任兵，劉 斌，等.丹參藥材化學(xué)成分HPLC指紋圖譜研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，29(3):188－192.

［5］洪莜坤，王智華.中藥數(shù)字化色譜指紋圖譜［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2003:5.