HPLC法測(cè)定蘭考泡桐花中洋芹素和熊果酸的含量

牛江龍， 趙建波， 陳佳銘， 吳德峰， 方 波， 盧艷花*， 韓海龍， 孟 華

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237;2.上海朝翔生物技術(shù)有限公司，上海201611)

泡桐屬(Paulownia)植物是玄參科(Scrophulariace)落葉喬木，原產(chǎn)于我國(guó)，現(xiàn)有9個(gè)種，4個(gè)變種［1］。蘭考泡桐(Paulownia elongata S.Y.Hu)是其中重要的一種，分布在中國(guó)大陸的山東、河南、江蘇、陜西、安徽、湖北等地，生長(zhǎng)于海拔800米的地區(qū)。蘭考泡桐常生長(zhǎng)在野外，目前尚未由人工引種栽培。泡桐不僅是材質(zhì)優(yōu)良的樹(shù)種，且其花、葉、果、樹(shù)皮、根均可入藥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)泡桐植物具有抗氧化［2］、抗菌［3］、抗病毒［4］等藥理活性。

泡桐花中主要含有三萜、倍半萜、黃酮、β-谷甾醇等多種化學(xué)成分［5，6］，其中以黃酮和三萜酸類物質(zhì)含量最為豐富。前期研究工作發(fā)現(xiàn)，洋芹素和熊果酸是蘭考泡桐花中的主要活性成分。由于其顯著藥理活性，泡桐花資源已引起人們廣泛的關(guān)注。但有關(guān)蘭考泡桐花中洋芹素和熊果酸含量的測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用高效液相色譜法測(cè)定蘭考泡桐花的中洋芹素和熊果酸的含量，為蘭考泡桐花資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀系列(脫氣機(jī)G1322A、四元泵G1311A、自動(dòng)進(jìn)樣機(jī)G1313A、柱恒溫箱G1316A和二極管陣列檢測(cè)器DAD G1315B);超聲波清洗器SCQ25-1(上海聲浦超聲波設(shè)備廠);自動(dòng)雙重純水蒸餾器1810B(上海申立玻璃儀器有限公司)。

1.2 材料

洋芹素和熊果酸對(duì)照品均是由本課題組從蘭考泡桐花中分離得到，含量≥98%，其FAB-MS、IR、1H NMR、13C NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［7-9］。泡桐花由上海朝翔生物技術(shù)有限公司提供，經(jīng)華東理工大學(xué)盧艷花教授鑒定為蘭考泡桐花。甲醇為色譜純(Caledon Laboratories LTD.Georgetown，Ont.，canada)，水為二次重蒸餾水。

2 蘭考泡桐花中洋芹素的含量測(cè)定

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(45∶55);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):340 nm;柱溫:24℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取洋芹素對(duì)照品，加甲醇配制成濃度為0.22 mg/mL的對(duì)照品溶液，4℃保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 蘭考泡桐花60℃干燥并粉碎后過(guò)20目篩，精密稱取5.0 g粉末，置于100 mL量瓶中，加75%乙醇80 mL，超聲提取60 min，放置至室溫，定容至刻度，搖勻。取1.0 mL溶液，10 000 r/min離心15 min，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別精密吸取對(duì)照品貯備溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得各濃度分別為 11.0，22.0，33.0，44.0，55.0 μg/mL對(duì)照品溶液。各對(duì)照品溶液進(jìn)樣20 μL，以對(duì)照品的含量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y=4 518.5X－40.77，R2=0.999 9(n=5)。測(cè)試結(jié)果表明，洋芹素的進(jìn)樣量在0.22～1.10 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

取上述洋芹素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積平均值為2 935.5，RSD=0.27%。測(cè)定結(jié)果表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批蘭考泡桐花粉末樣品5份，按照2.2.2項(xiàng)方法制備供試樣品溶液，測(cè)其峰面積，RSD=1.82%。測(cè)定結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述洋芹素對(duì)照品溶液，分別于0，2，4，8，12 h測(cè)定其峰面積，RSD=0.81% 。測(cè)定結(jié)果表明其在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的蘭考泡桐花粉末樣品1.0 g，共5份，分別精密加入洋芹素對(duì)照品溶液2.5 mL(0.22 mg/mL)，按照2.2.2項(xiàng)方法制備供試樣品溶液。處理后，按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 洋芹素加樣回收率試驗(yàn)

2.8 樣品測(cè)定

精密吸取洋芹素對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定分析，計(jì)算樣品中洋芹素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 洋芹素對(duì)照品與供試樣品HPLC圖譜

3 蘭考泡桐花中熊果酸的含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(90 ∶10);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:24℃。

3.2 溶液配制

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取熊果酸對(duì)照品，加甲醇配制成濃度為0.52 mg/mL的對(duì)照品溶液，4℃保存。

3.2.2 供試品溶液的制備 見(jiàn)2.2.2項(xiàng)。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別精密吸取對(duì)照品貯備溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得各濃度分別為 104.0，208.0，312.0，416.0，520.0 μg/mL對(duì)照品溶液。各對(duì)照品溶液進(jìn)樣20 μL，以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的含量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y=201.83X+77.87，R2=0.998 3。測(cè)試結(jié)果表明，熊果酸的進(jìn)樣量在2.08～10.40 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.4 精密度試驗(yàn)

取上述熊果酸對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積平均值為1 345.8，RSD=0.42%。測(cè)定結(jié)果表明精密度良好。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批蘭考泡桐花粉末樣品5份，按照2.2.2項(xiàng)方法制備供試樣品溶液，測(cè)其峰面積，RSD=1.71%。測(cè)定結(jié)果表明重復(fù)性良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述熊果酸對(duì)照品溶液，分別于0，2，4，8，12 h測(cè)定其峰面積，RSD=0.66%。測(cè)定結(jié)果表明其在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的蘭考泡桐花粉末樣品5份，精密加入熊果酸對(duì)照品溶液2.0 mL(0.52 mg/mL)，按照2.2.2項(xiàng)方法制備供試樣品溶液。處理后，按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 熊果酸加樣回收率試驗(yàn)

3.8 樣品測(cè)定

精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定分析，計(jì)算樣品中熊果酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖2。

表3 蘭考泡桐花中洋芹素與熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果(n=5)

圖2 熊果酸對(duì)照品與供試樣品HPLC圖譜

4 討論

取洋芹素和熊果酸對(duì)照品溶液，在200～400 nm掃描紫外吸收光譜，根據(jù)光譜顯示，分別選擇340 nm和210 nm作為其檢測(cè)波長(zhǎng)，這樣既可以避免流動(dòng)相對(duì)基線的影響，又提高檢測(cè)的靈敏度。

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法測(cè)定不同溶劑的蘭考泡桐花提取物中洋芹素和熊果酸的含量，該方法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，分離效果好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，為相關(guān)植物中洋芹素和熊果酸含量的測(cè)定提供了科學(xué)的分析手段，同時(shí)，為蘭考泡桐花開(kāi)發(fā)利用的進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

［1］中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院泡桐組.泡桐研究［M］.(第1版).北京:農(nóng)業(yè)出版社，1980，7:7-22.

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