慢病毒介導(dǎo)的解整合素－金屬蛋白酶17 RNA干擾對(duì)氣道上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)及NF-κB活性的影響

嚴(yán)建平，李亞清，鐘 暉，陳 淳，顧 超

肺組織彈性物質(zhì)的降解是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）特征性的病理表現(xiàn)［1］，也是導(dǎo)致COPD患者進(jìn)行性氣流受限的重要原因。蛋白酶－抗蛋白酶失衡在這一過程中發(fā)揮著重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）超家族成員之一。活化的MMP-9可作用于彈性蛋白及IV型膠原等，引起細(xì)胞外基質(zhì)損傷。MMP-9在COPD患者血清中的表達(dá)明顯升高，且與氣流受限和疾病進(jìn)展相關(guān)［2］。Foronjy等［3］通過轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)研究表明MMP-9的過表達(dá)和酶活性增加可導(dǎo)致肺泡彈性物質(zhì)的丟失、膠原含量減少，使肺組織發(fā)生肺氣腫樣改變。但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍有待于研究。解整合素－金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）17屬于ADAM蛋白酶家族成員之一，在與一系列生理、病理活動(dòng)有關(guān)的關(guān)鍵因子的細(xì)胞外域分離（shedding）過程中起著重要作用，被稱為“信號(hào)系統(tǒng)剪刀”。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡或生存等過程中起著重要作用。Wright等［4］研究表明香煙煙霧可通過 TNF-α信號(hào)通路上調(diào)肺血管MMP-9、MMP-2、MMP-12的表達(dá)。pro-TNF-α是可溶型TNF-α的前體，通過其胞外域水解脫落形成可溶型TNF-α，ADAM17在這一過程中起著重要作用。因此，我們推測(cè)ADAM17可能通過調(diào)控TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)中發(fā)揮作用。

RNAi（RNA interference）技術(shù)是一種新興的由外源性或細(xì)胞內(nèi)源性的雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，已在基因功能、發(fā)育生物學(xué)和基因治療等研究有了廣泛的應(yīng)用［5］。慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi不但可以感染非分裂期細(xì)胞，還具有容納外源性目的基因片段大、目的基因能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。因此，本課題通過構(gòu)建ADAM17 siRNA慢病毒表達(dá)載體，探討ADAM17 RNAi對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的 HBE4-E6／E7細(xì)胞 MMP-9表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究 TNF-α／核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路在其中的作用，為治療COPD提供新的研究靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 正常人氣道上皮細(xì)胞系HBE4-E6／E7購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，293T細(xì)胞系購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑和儀器 慢病毒包裝系統(tǒng) pLVTHM、pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G-VSVG購(gòu)自Trono（University of Geneva，Switzerland）.ClaI，MluI，XbaI和 EcoRI購(gòu)自 TaKaRa（Otsu，Shiga，Japan）。AxyPrep質(zhì)粒小劑量制備試劑盒購(gòu)自Axygen公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。RNAex購(gòu)自上海華舜公司。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin購(gòu)自 Promega（Madison，WI，USA）。SYBR Master Mixture購(gòu)自 Toyobo公司。Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京天為時(shí)代公司。LPS（來源于E.coli 0111∶B4）、DMEM培養(yǎng)液、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）、明膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Etanercept購(gòu)自美國(guó)Immunex公司。兔抗人MMP-9單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提取試劑盒以及LightShiftTMChemiluminescent EMSA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。二氧化碳培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司，倒置相差顯微鏡為日本OLYMPUS公司。

2 方法

2.1 ADAM17 siRNA設(shè)計(jì)、質(zhì)粒載體構(gòu)建及慢病毒包裝 根據(jù)人ADAM17 mRNA序列（Genebank number：NM＿003183）選擇位于2021-2041之間的特殊序列 5′-CCTATGTCGATGCTGAACAAA-3′為干擾靶序列。含干擾靶序列的DNA寡核苷酸由上海生物工程有限公司化學(xué)合成。并經(jīng)過退火，以ClaI和MluI雙酶切，在 T4 DNA連接酶的作用下插入pLVTHM表達(dá)載體。制備DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆，通過限制酶切和DNA直接測(cè)序鑒定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×109cells·L－1。取20μg重組 pLVTHM載體，10μg pMD2G-VSVG，10μg pMDlg-pRRE和10μg pRsv-REV加入無菌水定容至1 800μl，再加入 CaCl2（2.5 mol·L－1）溶液 200μl，混勻，加入 2×BBS緩沖鹽溶液2 000μl，室溫放置30 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。當(dāng)293T細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物和磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗3次。加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h；收集上清液，4℃、4 000 r· min－1離心 10 min，0.45μm濾器過濾上清液，離心后于－80℃冰箱保存。以慢病毒濃縮液感染293T細(xì)胞，采用倍比稀釋法和流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測(cè)病毒滴度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HBE4-E6／E7細(xì)胞復(fù)蘇后用含10% 胎牛血清、105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素DMEM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，充分混勻，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2.5 h后，消化、收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×109cells·L－1，進(jìn)一步培養(yǎng)。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，將HBE4-E6／E7細(xì)胞分成4組：第 3、4組分別以 1 mg·L－1etanercept（A recombinant human TNFR p75-Fc fusion protein）（Enbrel，Immunex，Seattle）、50 mg·L－1PDTC預(yù)處理30 min；接著第2、3、4組分別加入終濃度為100μg·L－1LPS刺激24 h，第1組未用 LPS刺激。在RNAi干擾實(shí)驗(yàn)中，一方面將HBE4-E6／E7細(xì)胞分成4組：第1組為空白對(duì)照組；第2組為L(zhǎng)PS刺激組；第3組以LV-NC-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6／E7細(xì)胞72 h，第4組以 LV-ADAM17-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6／E7細(xì)胞72 h，接著第3、4組以100μg·L－1LPS刺激24 h。另一方面將A549細(xì)胞分成4組：第1組為空白對(duì)照組；第2組為TNF-α刺激組；第3組以LV-ADAM17-siRNA慢病毒以MOI 15感染HBE4-E6／E7細(xì)胞72 h，接著以1 mg·L－1TNF-α刺激24 h；第4組以50 mg·L－1PDTC預(yù)處理 HBE4-E6／E7細(xì)胞30 min，接著以1 mg·L－1TNF-α刺激24 h。分別收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液，－80℃冰箱保存、備測(cè)。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng) 以TRIzol提出總RNA。按MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明合成cDNA：將2μg RNA與2μl Oligo（dT）15（0.5 g·L－1）混合，補(bǔ)充DEPC處理的無菌水至總體積為12μl，離心，70℃溫育5 min，迅速置冰上，分別加入5×buffer 5μl，RNase（40 U·μl－1）0.6μl，dNTP（10 mmol·L－1）1.25μl，MMLV（200 U·μl－1）1μl，補(bǔ)充DEPC處理的超純水至總體積為25μl，離心，37℃溫育1h，95℃5 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)目的基因分別加入：10×buffer 2.5μl，MgCl2（25 mmol·L－1）2.0μl，dNTP（10 mmol·L－1）1.0μl，上游引物（10μmol·L－1）1.0μl，下游引物（10μmol·L－1）1.0μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl，Taq酶 0.5μl，補(bǔ)充無菌去離子水至總體積為25μl，離心混勻，95℃預(yù)變性5 min，然后完成35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照、圖像灰度分析，將目的基因擴(kuò)增片段灰度值與內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增片段灰度值的比值作為目的基因mRNA表達(dá)的定量指標(biāo)。引物見Tab 1，由北京奧科生物科技公司設(shè)計(jì)和合成：MMP-9（Genebank：NM＿004994）引物，上游 5′-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′； 下 游 5′-GGCACAGTAGTGGCCGTAG-3′，產(chǎn)物 388bp。β-actin上游 5′-GGCACCACACCTTCTACAATGA-3′；下 游 5′-TCAGGAGGAGCAGCAATGATCTTG-3′，產(chǎn)物 745 bp。

Tab 1 Primer sequences and reaction conditions used for reverse transcriptase polymerase chain reaction

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 收集各組細(xì)胞上清液，2 000 r·min－1離心5 min，棄去沉淀，以 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的TNF-α濃度。根據(jù)TNF-αELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，主要步驟如下：每孔加入100μl稀釋液 RD1-85。分別加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品或待測(cè)樣品。室溫溫育2 h后吸干，反復(fù)洗滌4次。每孔加入100μl TNF-α結(jié)合物，室溫溫育1 h。吸干，洗滌4次。每孔加入200μl底物溶液，避光室溫溫育30 min。每孔加入50μl終止液終止反應(yīng)，30 min內(nèi)在450 nm測(cè)定其吸光值。

2.5 Western blot 將各組含20μg蛋白的上清液在100℃沸水中變性5 min，分別上樣于8%SDSPAGE加樣孔中，電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)染液移至膠底邊時(shí)，取下凝膠，4℃、350 mA電轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。接著將硝酸纖維素膜置于TBS-T（TBS、5%脫脂奶粉、0.1%Tween）中室溫孵育1 h。然后將硝酸纖維素膜在以1∶2 500稀釋的兔抗人MMP-9單克隆抗體中室溫孵育1 h。TBS-T洗膜5次后，將硝酸纖維素膜在以1∶40 000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）中室溫孵育1 h。TBST洗膜5次后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence solution，ECL）顯影。用 UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描攝像、圖像灰度分析。

2.6 凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn) 用NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提出試劑盒提出細(xì)胞核蛋白，按試劑盒說明操作。由北京奧科生物科技公司設(shè)計(jì)、合成NF-κB雙鏈寡核甘酸探針。生物素標(biāo)記NF-κB探針序列，x代表生物素：5′-xGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′（a），5′-xAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′（b）。未用生物素標(biāo)記 NF-κB探針序列：5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′（a），5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′（b）。以 Light-ShiftTMChemiluminescent EMSA試劑盒檢測(cè) NF-κB活性，步驟如下：制備5% 非變性聚丙烯酰胺凝膠，100 V預(yù)電泳30 min，室溫孵育含50μg·L－1Poly（dI·dC）、0.05%NP-40、50 mmol·L－1KCl、5 mmol·L－1MgCl2、10 mmol·L－1EDTA的結(jié)合反應(yīng)體系20 min后，加入5μl的5×loading buffer，混勻后取20μl結(jié)合反應(yīng)體系上樣，100 V電泳，接著以380 mA（～100V）電轉(zhuǎn)移1 h，使結(jié)合反應(yīng)體系至尼龍膜上。將膜置于干燥的紙上（有溴酚蘭面朝上）1 min，迅速用254 nm紫外燈距離膜0.5 cm處紫外交聯(lián)10 min。以ECL方法顯影，用UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、分析條帶，根據(jù)其灰度值分析NF-κB活性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)和單因素方差分析（組間差異用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)）。

3 結(jié)果

3.1 Etanercept和 PDTC對(duì) LPS誘導(dǎo)的 HBE4-E6／E7細(xì)胞MMP-9的表達(dá)及NF-κB活性的影響在LPS刺激下，HBE4-E6／E7細(xì)胞中MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見Fig 1；NF-κB的活性在LPS刺激下亦明顯增加（P＜0.05），見Fig 2。Etanercept和 PDTC明顯抑制 LPS誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)（P＜0.05），見 Fig 1；Etanercept和PDTC亦明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活性（P＜0.05），見 Fig 2。

3.2 慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi對(duì)LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)及NF-κB活性的影響 慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi可明顯降低HBE4-E6／E7細(xì)胞上清液中 TNF-α蛋白水平（P＜0.05），見 Fig 3，并明顯抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05），見Fig 4；當(dāng)以 LV-ADAM17-siRNA重組慢病毒感染HBE4-E6／E7細(xì)胞72 h，再以LPS刺激24 h，LPS誘導(dǎo)的 NF-κB的活性明顯下降（P＜0.05），見Fig 5。而當(dāng)以 LV-NC-siRNA重組慢病毒感染HBE4-E6／E7細(xì)胞72 h后再以 LPS刺激24 h，和僅以LPS刺激組比較，LPS誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及NF-κB的活性均無明顯變化（P＞0.05），見 Fig 4，5。

Fig 1 Effects of Etanercept and PDTC on MMP-9 mRNA（A and B）and protein（C and D）expressions induced by lipopolysaccharide（n＝6）

Fig 2 Effects of etanercept and PDTC on NF-κB activity induced by lipopolysaccharide（n＝4）

Fig 3 Effects of ADAM17 RNAi on TNF-αexpression of airway epithelial cells induced by lipopolysaccharide（n＝6）

Fig 4 Effects of ADAM17 RNAi on MMP-9 mRNA（A and B）and protein（C and D）expressions induced by lipopolysaccharide（n＝6）

Fig 5 Effects of ADAM17 RNAi on NF-κB activity induced by lipopolysaccharide（n＝4）

3.3 慢病毒介導(dǎo)的 ADAM17 RNAi不能阻斷TNF-α誘導(dǎo)的 MMP-9表達(dá)及 NF-κB活性 在TNF-α刺激下，HBE4-E6／E7細(xì)胞中 MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見 Fig 6，TNF-α可誘導(dǎo)NF-κB活性明顯升高（P＜0.05），見Fig 7。以LV-ADAM17-siRNA重組慢病毒感染HBE4-E6／E7細(xì)胞72 h后再以TNF-α刺激24 h，和僅以TNF-α刺激組比較，TNF-α誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及NF-κB的活性均無變化（P＞0.05），見 Fig 6，7。PDTC則明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)及 NF-κB的活性（P＜0.05），見 Fig 6，7。

4 討論

NF-κB是一種多向性核轉(zhuǎn)錄因子，因其與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子結(jié)合而得名。NF-κB廣泛存在于各種細(xì)胞中，可被TNF-α、LPS等多種因素激活，參與調(diào)控IL-8、TNF-α等多種基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫功能等過程中發(fā)揮重要作用［6－7］。PDTC是 NF-κB活化的特殊抑制劑，可抑制IκBα的降解、阻止IκB和 NF-κB復(fù)合體的解離，從而抑制NF-κB的活化過程［8］。本研究中 LPS刺激使HBE4-E6／E7細(xì)胞MMP-9表達(dá)明顯增加，NF-κB活性亦明顯升高，etanercept和PDTC則均可阻斷這一過程。這說明 TNF-α／NF-κB信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的HBE4-E6／E7細(xì)胞MMP-9表達(dá)中起重要的調(diào)控作用。Hozumi等［9］通過離體實(shí)驗(yàn)研究也表明TNF-α刺激可通過NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)正常人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)。

Fig 6 Effects of ADAM17 RNAi on MMP-9 mRNA（A and B）and protein（C and D）expressions induced by TNF-α（n＝6）

Fig 7 Effects of ADAM17 RNAi on NF-κB activity of airway epithelial cells induced by TNF-α（n＝4）

ADAM-17在proTNF-α轉(zhuǎn)化成可溶的TNF-α中起重要作用，雖然 MMP-7、MMP-14、MMP-17、ADAM-10也與 proTNF-α的脫落有關(guān)，但是 ADAM-17對(duì)proTNF-α的脫落作用是最強(qiáng)的，且其對(duì) proTNF-α脫落特異性是其他MMP對(duì)proTNF-α脫落特異性的100～1 000倍，故 ADAM-17又稱 TNF-α轉(zhuǎn)化酶（tumour necrosis factor-α converting enzyme，TACE）［10］。ADAM-17最顯著的功能是分離 TNF-α、表皮生長(zhǎng)因子、肝素結(jié)合樣表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α等多種跨膜蛋白的胞外域［11］。本研究中LPS刺激使HBE4-E6／E7細(xì)胞上清液TNF-α水平明顯升高，而慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi可降低LPS誘導(dǎo)的 HBE4-E6／E7細(xì)胞 TNF-α表達(dá)，明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性，使LPS誘導(dǎo)的MMP-9的表達(dá)相應(yīng)地明顯降低。但慢病毒介導(dǎo)的ADAM17 RNAi不能阻斷以TNF-α直接刺激所引起的MMP-9表達(dá)增加和NF-κB活性升高；而PDTC則仍可抑制TNF-α直接刺激引起NF-κB活化，并使TNF-α直接誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)明顯下降。說明ADAM17是通過調(diào)節(jié)TNF-α細(xì)胞外域脫落參加調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)過程，但不能直接阻斷TNF-α下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α／NF-κB信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)中起重要調(diào)控作用，慢病毒介導(dǎo)的 ADAM17 RNAi可通過阻斷 TNF-α／NF-κB信號(hào)通路的上游來調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，為COPD的治療提供了新的研究靶點(diǎn)。

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