正交試驗(yàn)優(yōu)選龍膽炮制工藝的研究

廖梅香 薛玉潔

摘要 [目的]比較龍膽生品、酒炙、姜炙、甘草炙、炒炭等不同炮制品中龍膽苦苷的含量，并利用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化其炮制工藝，探討提高龍膽苦苷含量的最佳炮制工藝。[方法]分別對(duì)龍膽藥材進(jìn)行不同的炮制處理，采用超聲法進(jìn)行提取，利用高效液相色譜法（HPLC）分別測(cè)定其含量，選擇龍膽苦苷含量最高的樣品進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化炮制工藝。[結(jié)果]龍膽不同炮制品中酒炙龍膽的含量高于其他炮制品。當(dāng)炮制溫度為100 ℃，悶潤(rùn)時(shí)間為1 h，龍膽與黃酒用量比例為5∶1時(shí)，龍膽苦苷含量最高。[結(jié)論]酒炙法是適用于龍膽的炮制方法，且最適宜的炮制條件為炮制溫度100 ℃、悶潤(rùn)時(shí)間1 h 、龍膽與黃酒用量比例5∶1。

關(guān)鍵詞 龍膽苦苷;高效液相色譜法;超聲提取法;正交試驗(yàn)

Abstract [Objective]To compare the content of gentiopicroside from Gentiana scabra Bge. in different processing technology such as the crude，carbonized products，and stirfrying with wine，ginger，glycyrrhiza products，further discuss and analyze the best processing method for increasing the content of gentiopicroside. [Method]HPLC method was applied to determine the content of gentiopicroside with ultrasonic extraction from different processed products. By comparison and analysis，the orthogonal test was carried out on the product with the highest content to optimize processing technology. [Result]In different processing products，the content of gentiopicroside in stir frying with wine products was higher than other products，and the content was highest when the temperature was 100 ℃，the moist time was 1 h，the proportion of G. scabra Bge. and wine was 5∶1. [Conclusion]The optimum method to process G.scabra Bge. was stirfrying with wine，and the concrete conditions were as follows： temperature was 100 ℃，the moist time was 1 h，the proportion of G.scabra Bge. and wine was 5∶1.

Key words Gentiopicroside;HPLC;Ultrasonic extraction method;Orthogonal test

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽（Gentiana manshurica Kitag.）、三花龍膽（Gentiana triflora PalL） 或堅(jiān)龍膽（Gewhawa rigescens Franch.）的干燥根和根莖，苦、寒，具有清熱燥濕、泄肝膽火之功效[1]。龍膽的主要化學(xué)成分為龍膽苦苷，具有護(hù)肝、鎮(zhèn)痛、利膽、抗菌抗病毒等作用[2]。

龍膽傳統(tǒng)的炮制方法有酒炒、炒炭、蜜炙等[3]。大多是通過(guò)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行炮制，定量分析報(bào)道較少[4]。筆者通過(guò)比較龍膽不同的炮制品，確定龍膽苦苷含量最高的一種炮制方法，進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)，以龍膽苦苷為指標(biāo)，采用高效液相色譜法對(duì)炮制工藝的主要影響因素進(jìn)行考察，篩選出最佳炮制工藝，使龍膽炮制品更好地發(fā)揮臨床效果，以期為龍膽藥材炮制方法的選擇提供更多的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥材與試劑

1.1.1 儀器。高效液相色譜儀（日本島津，SPD-15C）;超聲儀（KQ-500DB，昆山市超聲儀器有限公司）;分析天平（十萬(wàn)分之一，Quintix 125D-1CN，賽多利斯公司）;真空干燥箱（DZF-6050，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 藥材。龍膽生品由江西省仁和藥業(yè)有限公司購(gòu)入，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室老師鑒定，確定為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabra Bge.）的干燥根莖。

1.1.3 試劑。甲醇，分析純、色譜純（廣西西隴科學(xué)股份有限公司）龍膽苦苷對(duì)照品（規(guī)格20? mg，批號(hào)為110256-201815，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 龍膽的不同炮制品考察。

炮制生品龍膽、酒炙龍膽、炒炭龍膽、姜炙龍膽、甘草炙龍膽，分別粉碎過(guò)40目篩，放置干燥箱中備用。

1.2.2 酒炙龍膽單因素考察。

取龍膽飲片100 g 5份，分別于炮制溫度（60、80、100、130、160、180 ℃）、悶潤(rùn)時(shí)間（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h）、龍膽與黃酒用量比例（3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1）條件下進(jìn)行炮制，放冷，粉碎后過(guò)40目篩備用，測(cè)定龍膽苦苷的含量。

1.2.3 龍膽苦苷含量的測(cè)定。

1.2.3.1 對(duì)照品溶液的配制。

精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品9.45 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加入甲醇溶液稀釋并定容成每1 mL含0.945 mg的溶液。注意避光保存，備用。

1.2.3.2 HPLC色譜條件。色譜柱為C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為甲醇（水∶甲醇=75∶25）;流速1 mL;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;柱溫箱溫度30 ℃;進(jìn)樣量20 μL（進(jìn)樣前樣品用微孔濾膜過(guò)濾）。

1.2.3.3 供試樣品溶液的配制。

取各炮制品試樣粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定后，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，稱定重量，40 ℃超聲（400 W，45 kHz）提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，濾液備用;取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后作為供試品溶液，注意避光保存，備用。

1.2.3.4 線性關(guān)系的考察。精密吸取“1.2.3.1”中的龍膽苦苷對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL分別置于10 mL的棕色量瓶中，用甲醇定容后，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后作為各濃度的對(duì)照品溶液。按照“1.2.3.2”中的色譜條件測(cè)定，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，以龍膽苦膽峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=2×107X+45 630（R2=0.999 7），龍膽苦膽在0.004～0.189 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3.5 精密度試驗(yàn)。精密吸取龍膽苦苷對(duì)照品溶液20 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定龍膽苦苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.03%。

1.2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h 后按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得龍膽苦苷峰面積的RSD為1.37%。

1.2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)。

取龍膽樣品6份，按照“1.2.3”方法配制供試溶液，按照色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得龍膽苦苷峰面積的RSD為1.05%。

1.2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)。取已知含量的龍膽生品6份，每份0.2 g，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.189 mg/mL的龍膽苦苷對(duì)照品溶液5.0 mL，加甲醇定容稀釋至刻度，按照色譜條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率，得到RSD為1.19%。

1.2.4 龍膽苦苷含量測(cè)定。按“1.2.3.3”方法制備供試品溶液，按照“1.2.3.2”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)“1.2.3.4”中的回歸方程計(jì)算龍膽苦苷的含量。

1.2.5 炮制工藝條件的優(yōu)化。采用不同炮制方法炮制樣品，測(cè)定龍膽苦苷含量，選出其中龍膽苦苷含量最高的供試品炮制方法。中醫(yī)認(rèn)為，酒炒上行能矯其苦澀大寒的本性，用于虛弱病人則酒炒炭[5]。目前，酒制龍膽在臨床上仍被廣泛應(yīng)用，且甘草炙龍膽工藝繁瑣[6]，故多選擇酒炙龍膽，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討酒炙龍膽的最佳炮制工藝。

參照全國(guó)炮制規(guī)范中酒制龍膽的炮制方法[7]，通過(guò)單因素考察結(jié)果，選取影響較大的因素，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行工藝優(yōu)化，選擇炮制溫度（A）、悶潤(rùn)時(shí)間（B）、龍膽與黃酒用量比例（C）3個(gè)因素，考察指標(biāo)為龍膽苦苷含量，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，每次試驗(yàn)重復(fù)2次，取龍膽30 g，均勻噴灑不同用量的黃酒（C），充分拌勻，密閉悶潤(rùn)不同時(shí)間（B），取出后置于不同溫度（A）下炒制，炒干后取出，放冷。取樣測(cè)定，計(jì)算龍膽苦苷含量。

2 結(jié)果與分析

龍膽樣品及對(duì)照品溶液色譜圖見圖1。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

方差分析結(jié)果表明，影響龍膽苦苷含量的因素從主到次依次為炮制溫度（A）、悶潤(rùn)時(shí)間（B）、龍膽與黃酒用量比例（C）。最佳炮制工藝為A1B1C3，但出于對(duì)炮炙成本的綜合考量，A1B1C1的炮制工藝更適合用于生產(chǎn)中，即龍膽與黃酒用量比例為5∶1，悶潤(rùn)1 h后再在100 ℃下炮制。

按照上述優(yōu)選的最佳炮制工藝分別炮制龍膽3次，編號(hào)為樣品1、樣品2、樣品3，配制供試品溶液，并按照“1.2.3.2”中規(guī)定的色譜條件測(cè)定龍膽苦苷含量，分別為0.045 1、0.039 8、0.041 7 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

該試驗(yàn)首先在生品龍膽、酒炙龍膽、姜炙龍膽、炒炭龍膽、甘草炙龍膽中利用高效液相色譜法分別測(cè)定其龍膽苦苷含量，結(jié)果表明甘草炙龍膽與酒炙龍膽含量相當(dāng)且高于其他炮制樣品。綜合考慮文獻(xiàn)資料、試驗(yàn)操作復(fù)雜程度和耗費(fèi)時(shí)間[8-10]，選擇對(duì)酒炙龍膽進(jìn)行進(jìn)一步正交試驗(yàn)。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定炮制溫度、悶潤(rùn)時(shí)間、黃酒與龍膽用量比例3個(gè)因素對(duì)龍膽苦苷含量的影響。根據(jù)L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)表進(jìn)行炮制處理，制成供試品溶液，采用高效液相色譜法進(jìn)行龍膽苦苷含量測(cè)定。結(jié)果表明，這3種因素對(duì)龍膽苦苷含量的影響均不顯著，其中影響較大的是炮制溫度。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，酒炙龍膽的最佳炮制工藝如下：炮制溫度100 ℃、悶潤(rùn)時(shí)間1 h、龍膽與黃酒用量比例為5∶1。

該試驗(yàn)比較了龍膽生品、酒炙法、姜炙法、炒炭法、甘草炙法，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了龍膽的傳統(tǒng)炮制方法是酒炙法。選取龍膽苦苷含量為酒炙龍膽工藝優(yōu)化的考察指標(biāo)還有些單一，而關(guān)于酒炙龍膽的炮制機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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