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    建立更加穩(wěn)定和有效的兔耳瘢痕模型

    2009-03-30 09:46:04馮登超楊喜明薛宏斌賀光照
    中國美容醫(yī)學(xué) 2009年2期
    關(guān)鍵詞:羥脯氨酸動物模型瘢痕

    馮登超 楊喜明 薛宏斌 賀光照

    [摘要]目的:建立更加穩(wěn)定和有效的兔耳瘢痕模型。方法:選用16只新西蘭大耳白兔,分別在兔耳腹側(cè)中段作1cm×1cm的全層皮膚缺損共192個,以形態(tài)學(xué)、瘢痕增生指數(shù)及羥脯氨酸(HPr)的含量變化對創(chuàng)面愈合后形成的增生塊,進(jìn)行動態(tài)組織病理學(xué)、細(xì)胞增殖活性及膠原纖維合成等檢測。結(jié)果:兔耳腹側(cè)中段創(chuàng)面可產(chǎn)生類似于人類的增生性瘢痕,其發(fā)生率為 91.5%,增生塊最長持續(xù)時間可達(dá)120多天。結(jié)論:采用本實(shí)驗(yàn)的模型復(fù)制方法,可以得到更加穩(wěn)定和有效的兔耳增生性瘢痕。

    [關(guān)鍵詞]瘢痕;動物模型;羥脯氨酸

    [中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2009)02-0191-04

    Establishment of an animal model for hypertrophic scar

    FENG Deng-chao,YANG Xi-ming,XUE Hong-bin,HE Guang-zhao

    (1.Department of Plastic and Burning Surgery,Yan'an University Affiliated Hospital , Yan'an 716000,Shaanxi,China; 2.Department of Plastic and Burning Surgery,the First Affiliated hospital ,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

    Abstract:ObjectiveTo establish stable and reliable animal model of rabbit ear for hypertrophic scar.MethodsFull skin defect ( 1cm×1cm in diameter)was created on the ventral side of 32 ears in 16 New Zealand white rabbits.Wound healing under natural condition was observed continuously after the operation. The scar proliferation and index on the rabbit ears were observed by light microscope,the scar HPr content was determined by improved chloraseptine Toxidizing assay.ResultsThe animal model of hypertrophic scar induced by full thickness skin wounds on the ventral side of rabbit ears was similar to that in humans.Its incidence was 91.5 %.The hypertrophic scar could last 120 days.ConclusionFull thickness skin wounds on the ventral side of rabbit ears could produce stable and reliable hypertrophic scars.

    Key words: scar;mode1 animal;HPr

    增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是常見的病理性瘢痕,一直都是整形外科和創(chuàng)傷外科研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題,但其機(jī)理到目前尚未明確[1]。對其發(fā)生機(jī)制和防治的研究一直進(jìn)展甚微,最主要的原因是目前尚缺乏一種合適的動物模型。盡管曾有人采用了將人增生性瘢痕移植于裸鼠皮下的動物模型[2],但在有免疫缺陷的動物身上實(shí)驗(yàn),很難得出符合客觀實(shí)際的結(jié)論;1997年Morris等[3]觀察到兔耳內(nèi)側(cè)皮膚損傷后有真皮增生現(xiàn)象,并初步建立了急慢性瘢痕模型,為進(jìn)一步研究提供了一種新的途徑,但仍存在復(fù)制成功率低等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過改進(jìn)Morris的方法,建立一種更加穩(wěn)定、有效、復(fù)制率高的動物瘢痕模型。

    1材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料:選用新西蘭大白兔16只,2.3~2.5kg,兔耳健全,雌雄不拘,購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心(動物合格證號SCXK(渝)20020001),分籠飼養(yǎng)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 兔耳增生性瘢痕模型的制作:將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,瘢痕模型的制作參照Morris等[3]和李薈元等[4]方法,并加以改良,用30g/L戊巴比妥鈉1.0ml/kg (30mg/kg)作耳緣靜脈麻醉,兔耳腹側(cè)面皮膚碘伏、乙醇消毒,嚴(yán)格無菌操作技術(shù)下,在兔耳腹側(cè)中段沿長軸避開可見血管,作1cm×1cm大小創(chuàng)面,創(chuàng)面間隔1cm以上,去掉兔耳全層皮膚并用刮勺徹底刮除軟骨膜,創(chuàng)緣用電烙鐵燒灼,每耳6處(見圖1),共192個創(chuàng)面,術(shù)后創(chuàng)面暴露,待其自行愈合。

    1.2.2形態(tài)學(xué)觀察及標(biāo)本的收集:術(shù)后第1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天觀察創(chuàng)面愈合情況。術(shù)后第3、7、11、14、18、28、56、84天 同樣用30g/l戊巴比妥鈉作耳緣靜脈麻醉,每次隨機(jī)處死2只兔子,切取標(biāo)本, 切口在創(chuàng)面邊緣,垂直于兔耳皮膚表面,深及軟骨表面。將每個標(biāo)本平均分成2份,1份用4%多聚甲醛固定24h,常規(guī)脫水,透明,包埋,切片,然后分別進(jìn)行HE、VG染色;1份用液氮快速冷凍,后轉(zhuǎn)為低溫冰箱-80℃保存, 氯胺-T 法測定HPr含量。這樣在每個時間點(diǎn),每組有24個標(biāo)本,共8組。

    1.2.3主要觀察和檢測的指標(biāo):①創(chuàng)面愈合情況、上皮化時間及瘢痕增生情況;②瘢痕增生指數(shù)的變化;③瘢痕發(fā)生率;④增生塊組織中HPr的含量變化。

    1.2.4 HPr含量測定[5-6]:標(biāo)本稱重后勻漿,加入2mg/ml胃蛋白酶溶液1ml,4℃冰箱過夜,16 000rpm離心,取上清液0.5ml加6mol/ml 濃鹽酸1.5ml,封入安瓿瓶中,125℃烤箱3h。冷卻后加10mg/ml氫氧化鈉1.5ml,調(diào)pH 值至5~7,蒸餾水稀釋至5ml。取樣本1ml 加入檸檬酸緩沖液0.5ml、0.05mol/l氯胺-T 1ml氧化6min,加入3.15mol/ml過氯酸終止氧化5min,加入10%對二甲氨基苯甲醛1ml,100℃水浴2min,顯色后560nm比色。標(biāo)準(zhǔn)管中加入10μg/ml的L-HPr,空白管調(diào)零。最終結(jié)果計(jì)算:每克組織中HPr含量(mg/g)= 測量管光度值÷標(biāo)準(zhǔn)管光度值×10(μg/ml)÷100÷標(biāo)本重量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每組樣本數(shù)據(jù)以表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件t檢驗(yàn)及方差分析。

    2結(jié)果

    2.1 形態(tài)學(xué)變化及平均愈合時間:兔耳腹側(cè)全層皮膚缺損首先以血凝塊充填,隨后代之以肉芽組織,創(chuàng)面有少許滲出液。肉芽組織鮮紅,易出血,生長速度較快,但軟骨表面沒有肉芽組織生長。至傷后第6天創(chuàng)面比較干燥(見圖1),傷后第11~14天可見創(chuàng)面收縮,第l5~17天可見軟骨周邊己干燥壞死并向創(chuàng)面內(nèi)卷曲,周圍上皮及肉芽組織在壞死軟骨下向中心生長,創(chuàng)面周圍皮膚隆起,第l9~22天干燥壞死軟骨脫落,創(chuàng)面愈合,平均愈合時間(19.4±2.3)天,愈合區(qū)明顯高于周圍正常皮膚,此硬塊不斷高出皮面,開始呈淡紅色,在傷后第28天左右增生達(dá)到高峰(見圖2),其增生范圍不超過原創(chuàng)緣,厚度約為耳厚的3倍,增生性瘢痕表面無皮膚附件。傷后第56天左右增生性瘢痕開始軟化,色澤變淡,但仍高出皮面(見圖3),逐漸進(jìn)入消退期。傷后第84天增生性瘢痕,顏色接近兔耳正常膚色,略高出皮面,表面平整,觸之質(zhì)軟(見圖4)。兔耳增生性瘢痕可持續(xù)3~4個月。

    2.2 組織學(xué)結(jié)果:HE染色顯示在術(shù)后第28天增生性瘢痕組織真皮層明顯增厚,為周邊正常真皮層厚度的3.0~4.0倍,真皮中含大量排列致密、粗大的膠原纖維,排列混亂,呈旋渦狀或結(jié)節(jié)狀,形成膠原結(jié)節(jié)(見圖5),其間有少量炎性細(xì)胞。第56天可見真皮中成纖維細(xì)胞數(shù)目減少,血管數(shù)量減少,管腔閉塞,膠原纖維減少(見圖6),逐漸進(jìn)入消退期。

    2.3 HI及瘢痕發(fā)生率測定:術(shù)后第18、28、56和84天標(biāo)本同時進(jìn)行顯微鏡下用測微尺測量瘢痕的相對增生厚度,設(shè)定瘢痕的高度(Scar height)為SH,正常皮膚高度(dermis height)為DH,則瘢痕增生指數(shù)(Hypertrophic Index,HI)HI=SH/DH。瘢痕組織高度≥2mm,硬度與兔耳軟骨相似時即為增生性瘢痕[7]。

    表1結(jié)果顯示,術(shù)后第28天組和56天組HI分別為4.15mm、3.68mm,與術(shù)后第18、84天組進(jìn)行比較,差異均有顯著性意義(P<0.05)。術(shù)后第18天瘢痕發(fā)生率只有25%,而術(shù)后第28天瘢痕發(fā)生率高達(dá)91.7%,術(shù)后第56天仍維持在較高水平,至術(shù)后第84天仍有33.3%的瘢痕HI大于2mm。

    2.3 HPr測定:表2和圖7結(jié)果顯示,術(shù)后第7天創(chuàng)緣內(nèi)組織塊的HPr含量開始增加,但增加不顯著,而術(shù)后11~18天,突出組織塊的HPr含量顯著增加,至28天達(dá)到高峰,約為正常皮膚HPr含量的3.6倍,56天以后開始逐漸下降。各組與兔耳正常皮膚組比較,差異均有顯著性意義(P<0.01)。

    3討論

    在創(chuàng)傷愈合的研究中,人與動物的傷口都可以出現(xiàn)瘢痕性愈合,但是增生性瘢痕在動物身上很少出現(xiàn),建立有效和穩(wěn)定的增生性瘢痕動物模型比較困難?,F(xiàn)有關(guān)于病理性瘢痕的研究資料,主要來源于三種途徑:一是通過體外瘢痕組織培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究;二是將人的病理性瘢痕組織移植到裸鼠的皮下,借助對寄生狀態(tài)下的瘢痕組織進(jìn)行觀察;三是通過臨床病例的觀察及術(shù)后標(biāo)本的分析研究。這些方法都有一定的缺憾:①成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系是體外實(shí)驗(yàn),無法很好的模擬人體內(nèi)環(huán)境和條件;②將人的增生性瘢痕組織移植于裸鼠皮下,它并不是動物自身產(chǎn)生的瘢痕組織,被移植的人類瘢痕組織脫離了人體環(huán)境,是“寄生”于裸鼠身上,對于這種處于非生理環(huán)境下的組織,想要研究觀察瘢痕的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的全過程是不可能的;其不能完整反映創(chuàng)面愈合至增生性瘢痕形成整個動態(tài)變化過程,得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會有一定的偏差[2];③臨床觀測無法細(xì)致的研究瘢痕的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。然而,只有在動物本身產(chǎn)生的瘢痕模型上,才能更確切、更直接、更深入地研究瘢痕發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸。

    以往由于缺乏動物自己產(chǎn)生的增生性瘢痕動物模型,對創(chuàng)面愈合的研究和增生性瘢痕的研究不能互相聯(lián)系。最近,第四軍醫(yī)大學(xué)李薈元等[8]研究建立的兔耳增生性瘢痕模型,為這兩個方面研究的結(jié)合提供了條件。李希軍等[5,9]研究發(fā)現(xiàn)保留軟骨去除軟骨膜可以獲得更大的瘢痕并且延長瘢痕的增生期,因?yàn)槁懵兜能浌菬o組織營養(yǎng)而導(dǎo)致部分軟骨壞死,肉芽生長是通過溶解作用從壞死軟骨下向中心生長,延緩了創(chuàng)面愈合速度,導(dǎo)致肉芽組織在創(chuàng)面周圍的堆積,最后形成較大的瘢痕。

    本實(shí)驗(yàn)HPr含量測定結(jié)果顯示,術(shù)后7天創(chuàng)緣內(nèi)瘢痕組織的HPr含量開始增加,但增加不顯著,而術(shù)后第11~18天,突出瘢痕組織內(nèi)的HPr含量顯著增加,至28天達(dá)到高峰,56 天出現(xiàn)下降趨勢。

    以往有關(guān)兔耳模型瘢痕發(fā)生率和HI的報(bào)道比較多,但術(shù)后瘢痕發(fā)生率一般不超過80%[6,10]。測定HI及瘢痕發(fā)生率結(jié)果顯示,本模型在牛扶幼等[11]方法上稍有改進(jìn),術(shù)后第28天組和56天組HI分別為4.15mm、3.68mm,與術(shù)后第18、84天組進(jìn)行比較,差異均有顯著性意義(P<0.05)。術(shù)后第28天瘢痕發(fā)生率高達(dá)91.7%,術(shù)后第56天仍維持在83.3%較高水平,至術(shù)后第84天仍有33.3%的HI大于2mm。結(jié)果可見,經(jīng)改良后兔耳創(chuàng)面瘢痕具有很好的有效性和穩(wěn)定性。保留軟骨,切除皮膚并刮除軟骨膜,由于加深了對創(chuàng)面的損傷程度,從而延緩了創(chuàng)面愈合的速度,因此兔耳創(chuàng)面能產(chǎn)生更加穩(wěn)定和有效的增生性瘢痕。本模型可以用作動態(tài)的研究藥物防治增生性瘢痕的實(shí)驗(yàn)動物模型。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Burd A ,Huang L.Hypertrophic response and keloid diathesis:two very different forms of scar[J].Plast Reconstr Surg,2005,116(7):150e-157e.

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    [4]李薈元.創(chuàng)傷研究動物模型--兔耳瘢痕模型的建立與應(yīng)用[M].西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社,2005:42-43;74-76.

    [5]李希軍,柳大烈,張陽.透明質(zhì)酸及透明質(zhì)酸酶對兔耳創(chuàng)面增生性瘢痕形成影響的對比研究[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2001,7(4):194-197.

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    [8]李薈元,劉建波,蘭海.建立增生性瘢痕動物實(shí)驗(yàn)?zāi)P蚚J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).1998,19(6): 655-657.

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    [10]周勤生,馬少林,董祥林.兔耳增生性瘢痕動物模型的建立與應(yīng)用[J].新疆醫(yī)科大學(xué)報(bào),2005,28(8):746-748.

    [11]牛扶幼,牛永敢,陳言湯.兔耳增生性瘢痕模型的建立[J].中國醫(yī)學(xué)工程,2004,12(5):12-14;17.

    [收稿日期]2008-10-11[修回日期]2008-12-22

    編輯/張惠娟

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