皮膚致敏性動物替代模型的研究進展

曹玉萍　馬鵬程　劉維達

曹玉萍綜述，馬鵬程 劉維達 審校

隨著人們對生存環(huán)境及動物保護的熱切關(guān)注，自動物實驗的減少（reduce）、優(yōu)化（refine）和替代（replace）這一3R原則提出以來，生命科學(xué)研究盡量避免使用傳統(tǒng)的試驗對象---動物，以器官培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)、人工器官的構(gòu)建等等取而代之。在皮膚科領(lǐng)域，各種接觸皮膚的外用藥物及各類化妝品除了對皮膚起到治療和美化作用以外，人們十分關(guān)注它們是否會給皮膚造成傷害；另外，過敏性皮膚病是十分常見，傳統(tǒng)的檢測皮膚致敏性的方法主要是以豚鼠為研究對象的最大值實驗、封閉型斑貼實驗和開放型斑貼實驗，以及人體斑貼實驗。本文就近年來引起了廣泛關(guān)注的皮膚致敏性動物替代模型進行了綜述。

1減少和優(yōu)化動物實驗的方法

經(jīng)典的豚鼠相關(guān)的檢測致敏性的實驗方法多是選取20～30只豚鼠，通過涂抹或皮下注射受試物和福氏完全佐劑數(shù)十天后，給予激發(fā)劑量的受試物，觀察豚鼠局部皮膚紅斑，結(jié)痂，水腫形成等對受試物的致敏性作出評價。

作為替代的小鼠實驗方法有鼠耳廓腫脹試驗法（mouse ear swelling test，MEST）、非侵入性鼠耳廓腫脹分析法（noninvasive mouse ear swelling assay，MESA）和小鼠局部淋巴結(jié)分析法（local lymph node assay，LLNA）。MEST和LLNA均已通過實驗室間的驗證，推薦為可靠的檢測中等到高度致敏物質(zhì)的方法。1992年經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）關(guān)于皮膚致敏的相關(guān)條例指出MEST和LLNA作為第一階段的檢測手段，一旦兩種中的任何一個出現(xiàn)陽性結(jié)果，該物質(zhì)可被認為是潛在的致敏物質(zhì)，而無須進行豚鼠實驗，若為陰性檢測結(jié)果，則需進一步進行豚鼠實驗以進一步驗證[1]。

1.1 鼠耳廓腫脹試驗法：MEST法出現(xiàn)于20世紀80年代，該方法是預(yù)先向小鼠腹部皮內(nèi)注射福氏完全佐劑，再多次用膠帶剝脫法剝離角質(zhì)層后，涂受試物，10天后，將受試物涂于一側(cè)耳廓，分別記錄涂藥前后24h及48h耳廓厚度的變化，鼠耳廓腫脹厚度超過20%者判為致敏物[2]。作為一種耗資低、試驗周期短、評分客觀，可定量的方法替代豚鼠實驗用于檢測化學(xué)物質(zhì)引起的遲發(fā)性接觸超敏反應(yīng)，而且該方法的判斷指標(biāo)不易被受試物顏色干擾，隨后推廣至光毒反應(yīng)、光敏反應(yīng)等。

1.2 非侵入性鼠耳廓腫脹分析法：MESA法作為接觸性過敏性皮炎的檢測手段，是遲發(fā)型超敏反應(yīng)的模型，基本方法為在小鼠腹部局部涂抹受試物使之致敏，5天后，在耳部皮膚外用同一受試物，在24h，48h，72h后測量耳部的腫脹程度，評估受試物致敏潛能。與MEST法相比，它的優(yōu)點在于少了很多侵入性的操作，如向小鼠腹部皮下注射福氏完全佐劑、麻醉小鼠、破壞腹部皮膚的角質(zhì)層屏障等，此外，它還可檢測極低濃度的已知致敏物導(dǎo)致接觸性致敏性皮炎的潛能，給予小鼠高維生素A飲食時， MESA法的反應(yīng)強度可放大數(shù)倍，可用于弱效致敏物的檢測。給予高維生素A飲食時的MESA法可檢出一般飲食MESA法和豚鼠實驗中出現(xiàn)假陰性物質(zhì)，MESA法靈敏度高于人體試驗，與豚鼠實驗相當(dāng)[3]。

1.3 小鼠局部淋巴結(jié)分析法：LLNA法原理是皮膚接觸致敏物，在致敏階段可引起局部引流的淋巴結(jié)內(nèi)T細胞發(fā)生活化和增殖。設(shè)置高中低三個濃度實驗組和賦形劑對照組，每組4～5只小鼠，連續(xù)3天在耳背外用受試物，用放射性元素3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷由尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，5h后處死，取其耳旁淋巴結(jié)制成單細胞懸液，測定細胞分裂數(shù)，增殖超過3倍以上判為致敏物。該方法進一步減少了動物使用數(shù)量，減輕了實驗動物的痛苦，經(jīng)改良后，用無放射性的5-溴-2-脫氧尿苷或熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）代替放射性元素來減少放射性污染。與豚鼠實驗、MEST法和人體最大值試驗相比，該方法穩(wěn)定且特異，檢測指標(biāo)客觀，且可定量[4-5]。該法早在1990年就獲得了ECVAM認證作為皮膚過敏試驗的替代方法。雖會出現(xiàn)一定的假陽性率，如對刺激物十二烷基磺酸鈉（SDS）反應(yīng)陽性，但在替代傳統(tǒng)的動物試驗上具有重大意義和優(yōu)勢[4]。

2完全替代動物實驗的方法

在MEST法、MESA法和LLNA法中，盡管以小動物替代了大動物，減少了動物的用量，但對實驗動物仍有需求，而動物替代方法的最終目標(biāo)是要找到合理的方法完全替代實驗動物，因此，科學(xué)家們一直在尋找各種能替代動物實驗的細胞培養(yǎng)方法。

2.1 單種細胞的培養(yǎng)

皮膚變態(tài)反應(yīng)的機制涉及角質(zhì)形成細胞和Langerhans細胞，在受到外源性物質(zhì)刺激后，角質(zhì)形成細胞分泌各種細胞因子，包括IL-1α、TNFα、GM-SCF、IL-8、IFNγ等等。Langerhans細胞接受微環(huán)境的刺激，表達各種成熟標(biāo)記物如CD86、CD54、CD40、CXCR4等等，分泌細胞因子如IL-1β等。

2.1.1 角質(zhì)形成細胞的液面下培養(yǎng)：以細胞為基礎(chǔ)的皮膚變態(tài)反應(yīng)替代模型最初以角質(zhì)形成細胞為研究對象，在眾多分泌的細胞因子中，IL-8、IL-1α的變化更有代表性。商品化的人角質(zhì)形成細胞、鼠源性角質(zhì)形成細胞株HEL30及原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞，發(fā)現(xiàn)IL-8在多種刺激物作用后增加，而致敏物作用后其基線水平不改變或降低。IL-1α在接觸致敏物接觸后可導(dǎo)致其在細胞內(nèi)分泌量增加，而刺激物及致敏物均導(dǎo)致其自細胞內(nèi)的釋放量增加，不僅如此，細胞因子分泌模式因化學(xué)物質(zhì)的不同也有較大的差異[6]。

2.1.2 角質(zhì)形成細胞的三維培養(yǎng)：與單純的細胞液下培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)更接近正常生理結(jié)構(gòu)，體外實驗數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確可靠。角質(zhì)形成細胞三維培養(yǎng)建立起角質(zhì)層屏障，將外源性物質(zhì)的滲透能力納入考察范圍，更符合皮膚變態(tài)反應(yīng)機制。Coquette A等[7]以氣液界面培養(yǎng)的方法建立人角質(zhì)形成細胞的三維培養(yǎng)體系，在該體系中，角質(zhì)形成細胞分化出角質(zhì)層、顆粒層和棘層。形成較為完備的角質(zhì)層屏障，以細胞因子IL-1α和IL-8的變化作為評價指標(biāo)，刺激物作用時，IL-1α水平顯著升高，而在中等或強效致敏物作用下，IL-8分泌量的增加更為顯著。在單層細胞培養(yǎng)體系和三維培養(yǎng)體系中，IL-8分泌的不同可能是由于化學(xué)物質(zhì)在單層培養(yǎng)體系中直接作用于細胞，而三維培養(yǎng)體系中需要透過角質(zhì)層屏障才能對角質(zhì)形成細胞起作用導(dǎo)致的。

目前以鼠尾膠原和成纖維細胞構(gòu)成的組織工程真皮為支撐的角質(zhì)形成細胞的三維培養(yǎng)模型已經(jīng)作為人工皮膚得到廣泛運用，如Episkin、EpiDerm等產(chǎn)品已獲得歐盟替代方法驗證中心通過，作為檢測化學(xué)物質(zhì)的皮膚刺激性的動物替代方法運用于化妝品的生產(chǎn)中。

但尚無類似產(chǎn)品可用于致敏性的檢測，原因可能在于角質(zhì)形成細胞三維培養(yǎng)模型中不含專職的免疫細胞，而皮膚變態(tài)反應(yīng)是一個典型的有專職免疫細胞參加的過程，在變態(tài)反應(yīng)中，角質(zhì)形成細胞與Langerhans細胞通過細胞因子產(chǎn)生相互影響。該模型所檢測物質(zhì)限于中等或強效者，是否具有足夠的靈敏度檢測出致敏作用很弱的化學(xué)物質(zhì)還不清楚。

2.1.3 樹突狀細胞的液面下培養(yǎng)：角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)模型是通過檢測細胞受到刺激物或致敏物作用后，IL-1α和IL-8的改變，從而做出判斷。但細胞因子的分泌模式在一定程度上有化學(xué)物質(zhì)的特異性，導(dǎo)致假陽性和假陰性的出現(xiàn)。因為不是專職的免疫細胞，角質(zhì)形成細胞模型不能較好的區(qū)分刺激物和致敏物。

Langerhans細胞作為皮膚中主要的抗原遞呈細胞，占表皮細胞數(shù)目的3%，但在皮膚變態(tài)反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，它不易從皮膚中分離，即使分離得到，不僅產(chǎn)量低，且細胞活力差[6]。有人將臍血或骨髓中CD34+造血祖細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成樹突狀細胞，或?qū)⑼庵苎獊碓吹膯魏思毎T導(dǎo)成樹突狀細胞，檢測細胞表面標(biāo)記物HLA-DR、CD54、CD80、CD86的變化區(qū)別致敏原及刺激物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此類體外模型敏感性不夠高，且細胞制備周期復(fù)雜，耗時長，同時存在細胞供體不同的個體差異性[8]。為解決個體差異性問題，多種單核細胞永生化細胞系受到極大關(guān)注，如THP-1細胞、MUTZ-3細胞、KG-1細胞、U937細胞等，雖然U937細胞構(gòu)建的模型表現(xiàn)出敏感性不高，具有中度致敏潛能的羥基肉桂酸被誤檢為陰性[9]。KG-1細胞、U937細胞針對致敏化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)因所檢測物質(zhì)的理化性質(zhì)不同而出現(xiàn)各種反應(yīng)，特異性不夠高，而且無法將致敏物和刺激物區(qū)分開。但THP-1細胞、MUTZ-3細胞代表性較好，對化學(xué)物質(zhì)致敏潛能的反應(yīng)主要表現(xiàn)為細胞表面標(biāo)記物（CD86、CD54）表達水平上調(diào)，而刺激物則不影響CD86、CD54的表達[10]。Sakaguchi等[11]建立h-CLAT模型分析了THP-1細胞活力及CD86/CD54表達與體外皮膚致敏性檢測之間的關(guān)系，以CD86≥150，CD54≥200為標(biāo)準(zhǔn)，判斷致敏物的準(zhǔn)確度在93%，這一標(biāo)準(zhǔn)與LLNA的EC3標(biāo)準(zhǔn)有很好的一致性。除了檢測免疫細胞表面共刺激分子的變化，以鼠源性的樹突狀細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)致敏物不僅使細胞表面CD40表達增加，同時CXCR4的水平也明顯提高，而刺激物則降低兩者的表達水平[12]。

除了以各類細胞標(biāo)志物為終末檢測指標(biāo)以外，Hooyberghs等[13]以來源于73名志愿者的CD34+造血祖細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成的樹突狀細胞為對象，在三個不同的時間點，用三種不同濃度的致敏物或刺激物作用于培養(yǎng)的細胞，通過13個基因的轉(zhuǎn)錄組分析來區(qū)別致敏物和非致敏物，一致性達89%，特異性高達97%，敏感性為82%。

上述誘導(dǎo)的樹突狀細胞及替代Langerhans細胞的細胞系都存在兩方面的問題：①這類單細胞培養(yǎng)模型缺乏角質(zhì)層屏障，無法考察受試化學(xué)物質(zhì)經(jīng)角質(zhì)層屏障的滲透能力；②一種細胞的單層培養(yǎng)模型缺乏角質(zhì)形成細胞與Langerhans細胞間的相互影響，不能完全反映人體變態(tài)反應(yīng)過程。

2.2 多種細胞的培養(yǎng)

為了解決單種細胞培養(yǎng)模型中的檢測指標(biāo)特異性不夠強，敏感性不夠高等問題，參照變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的不同環(huán)節(jié)，建立多種細胞共培養(yǎng)和三維培養(yǎng)是動物替代試驗發(fā)展的新趨勢。

2.2.1 角質(zhì)形成細胞與Langerhans前體細胞的共培養(yǎng)：通常認為在致敏物接觸局部皮膚時，角質(zhì)形成細胞受到致敏物的刺激后，分泌IL-1α、IL-8等細胞因子，向Langerhans細胞提供危險信號，提高Langerhans細胞對致敏物的敏感性。臍血或骨髓CD34+造血前體細胞，或外周血的單核細胞，在某些細胞因子作用下能發(fā)生誘導(dǎo)分化，具有Langerhans細胞相關(guān)的免疫功能，Schreiner等[14]將角質(zhì)形成細胞與來源于外周血的CD14+單核細胞共培養(yǎng)，加入GM-SCF、IL-4、TGFβ等誘導(dǎo)CD14+單核細胞分化成樹突狀細胞，用于檢測化學(xué)物質(zhì)的致敏性，發(fā)現(xiàn)致敏物三硝基苯磺酸、對苯二胺、4-氨基乙酰苯胺等接觸性致敏原可使培養(yǎng)體系中的樹突狀細胞表面CD86表達增加，刺激物十二烷基磺酸鈉則不會引起類似的變化。

2.2.2 Langerhans前體細胞與T細胞的共培養(yǎng)：皮膚變態(tài)反應(yīng)致敏期，Langerhans細胞接觸致敏化學(xué)物質(zhì)，發(fā)生活化，分泌IL-1β，攝取加工抗原，逐漸成熟，向局部淋巴結(jié)遷移，激活初始輔助性T細胞，使之發(fā)生活化增殖?；谶@一機制，Rouginer等[15]用來源于臍血CD34+造血干細胞的Langerhans細胞樣樹突狀細胞，或?qū)⑼庵苎械膯魏思毎?jīng)GM-SCF、IL-4等細胞因子誘導(dǎo)，得到有成熟樹突狀細胞表型的細胞，作為抗原遞呈細胞受到強效致敏物作用后，能誘發(fā)自體初始T細胞大量增殖，但弱致敏原或刺激物SDS則不會引起類似變化。

2.2.3 含有多種細胞的三維培養(yǎng)：人表皮含有角質(zhì)形成細胞、Langerhans細胞、黑素細胞和邁克爾細胞。僅角質(zhì)形成細胞的三維培養(yǎng)或各類兩種細胞的液下共培養(yǎng)體系不能完全反映出人體皮膚屏障作用，且樹突狀細胞、T細胞的來源，不同供者間的差異都成為該類模型進一步發(fā)展的難題。將CD34+造血祖細胞、角質(zhì)形成細胞和黑素細胞三者共培養(yǎng)于真皮支架上構(gòu)建出組織工程皮膚，更接近正常人皮膚[16]。Facy V等[17]建立了分層培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞與CD34+造血祖細胞共培養(yǎng)模型，2，4-二硝基氟苯、對苯二胺等致敏物可導(dǎo)致IL-1β、CD86過度表達。該模型采用來源于臍血的CD34+造血祖細胞，來源少，存在個體差異，無法推廣。最近，Uchino等[18]成功的建立了含有角質(zhì)形成細胞和樹突狀細胞的三維培養(yǎng)模型，將致敏物/非致敏物暴露于這種新的皮膚模型上1h，測得致敏物可導(dǎo)致該模型中細胞因子分泌增加，且樹突狀細胞表面CD86表達增加，而非致敏物則不會引起上述改變。

3結(jié)語

各種替代動物實驗的方法已廣泛開展，檢測致敏性的動物替代模型在化妝品檢測中尤為重要， 2009年起禁用動物進行化妝品的各項安全性測試已列入WTO協(xié)議的相關(guān)條款，隨著皮膚變態(tài)反應(yīng)機制研究的深入，皮膚致敏性檢測模型從最初的動物模型逐漸發(fā)展為細胞液下培養(yǎng)模型，考慮到細胞間相互影響以及角質(zhì)層屏障，多種細胞的共培養(yǎng)模型及三維培養(yǎng)模型成為熱點，但細胞來源及個體差異性仍未得到很好的解決，檢測指標(biāo)由最初的細胞因子和細胞表面標(biāo)記物的變化，逐漸發(fā)展到通過相關(guān)基因的檢測來判斷化學(xué)物質(zhì)是否致敏。Koeper等[19]用鼠皮膚移植物，人皮膚移植物以及人工皮膚模型研究致敏物對信號傳導(dǎo)通路的影響，發(fā)現(xiàn)在皮膚移植物中，三種MAPK均被致敏物活化，而對刺激物無反應(yīng)。在人工皮膚模型中，致敏物作用后可檢測到磷酸化p38和JNK1/2，刺激物作用后可檢測到ERK1/2。MAPK細胞信號通路為皮膚致敏性檢測提供了一個新工具。隨著皮膚變態(tài)反應(yīng)深入研究，皮膚致敏性檢測模型的發(fā)展從解決細胞來源，存在批間差異等問題著手，在保證靈敏性和特異性的前提下，尋找來源廣，性狀穩(wěn)定均一，與角質(zhì)形成細胞構(gòu)建三維模型復(fù)制性強的能體現(xiàn)Langerhans細胞相關(guān)功能的免疫細胞是未來動物替代方法發(fā)展的方向。另一方面，對于終末檢測指標(biāo)的確定，從細胞因子、表面標(biāo)記物發(fā)展到基因表達的檢測和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，越來越深入細致。能提高檢測的靈敏度的多種檢測指標(biāo)的組合將是未來研究的方向。

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[收稿日期]2008-11-15[修回日期]2009-01-05

編輯/張惠娟