食品中金黃色葡萄球菌定量檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證的質(zhì)量控制

雷蘭蘭 康婕 王瑛 鄭玉紅 郭玉凡 張曼

摘 要：能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室校準(zhǔn)或檢測(cè)能力的重要手段，合理的質(zhì)量控制是確保能力驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。本文分別從試劑耗材、操作過(guò)程、儀器設(shè)備、人員及環(huán)境等5個(gè)方面對(duì)食品中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證的影響因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行分析，以期為食品微生物實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌;能力驗(yàn)證;質(zhì)量控制

Quality Control of Proficiency Testing for Quantitative Testing of Staphylococcus aureus in Food

LEI Lanlan， KANG Jie， WANG Ying， ZHENG Yuhong， GUO Yufan， ZHANG Man

（Shaanxi Province Product Quality Supervision and Inspection Institute， Xi’an 710048， China）

Abstract： Proficiency testing is an important method to evaluate laboratory calibration or testing ability by using inter-laboratory comparison. Reasonable quality control is the key to ensure the accuracy of proficiency testing test results. In this paper， the influencing factors and key links of proficiency testing for quantitative detection of Staphylococcus aureus in food are analyzed from five aspects： reagent consumables， operation process， equipment， personnel， and environment， so as to provide reference for the quality control of food microbiology laboratory proficiency testing.

Keywords： Staphylococcus aureus; proficiency testing; quality control

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染，也是常見(jiàn)的食源性致病菌，一旦食物保存不當(dāng)，金黃色葡萄球菌可大量繁殖，可引起食物中毒。在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》

（GB 29921—2021）[1]里的13類(lèi)食品中有8類(lèi)食品對(duì)金黃色葡萄球菌的指標(biāo)作出了限量要求，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》

（GB 31607—2021）[2]的3類(lèi)食品均對(duì)該菌的指標(biāo)作出了限量要求。

近年來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)食品安全問(wèn)題重視程度的增加，對(duì)食品檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的能力要求也越來(lái)越高。能力驗(yàn)證（Proficiency Testing）是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來(lái)判定實(shí)驗(yàn)室和檢查機(jī)構(gòu)能力的活動(dòng)，也是認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國(guó)際相互承認(rèn)協(xié)議（MRA）的必要條件之一。對(duì)于已經(jīng)獲得或者申請(qǐng)CNAS認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室，參加能力驗(yàn)證活動(dòng)是強(qiáng)制性的，《能力驗(yàn)證領(lǐng)域和頻次表》（CNAS-AL07-CNAS）中要求食品微生物領(lǐng)域每年至少參加一次能力驗(yàn)證[3]。作為微生物致病菌指標(biāo)之一，金黃色葡萄球菌也是食品微生物能力驗(yàn)證考核常見(jiàn)的一個(gè)項(xiàng)目。參加者收到的樣品一般為白色凍干塊狀，需要按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求，用一定體積的無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水再水化后，再按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）[4]第2法金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)，該檢驗(yàn)方法的操作步驟包括樣品的水化、系列稀釋、接種、培養(yǎng)、典型菌落計(jì)數(shù)、結(jié)果計(jì)算以及報(bào)告。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不但包括典型及可疑菌落計(jì)數(shù)，還包括目標(biāo)菌的鑒定，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有各種細(xì)節(jié)問(wèn)題需要注意，因此具有一定的難度。所以為了得到滿意的能力驗(yàn)證結(jié)果，需要從接到樣品到接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終貫穿合理的質(zhì)量

控制。

1 作業(yè)指導(dǎo)書(shū)

不同于普通食品，為了保證均勻性和穩(wěn)定性，參加者接收到的能力驗(yàn)證樣品一般為凍干粉，并隨附一份作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，用于規(guī)范檢驗(yàn)前后的一些事項(xiàng)操作過(guò)程，如樣品的保存、水化、檢驗(yàn)以及結(jié)果報(bào)告。因此參加者收到能力驗(yàn)證樣品后首先應(yīng)該仔細(xì)研讀作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，如果不能及時(shí)檢驗(yàn)，先將樣品按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)的要求進(jìn)行冷藏或者冷凍保存，及時(shí)按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)的要求準(zhǔn)備水化試劑和檢驗(yàn)試劑，檢驗(yàn)完成后在規(guī)定的時(shí)限內(nèi)按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)規(guī)定的方式進(jìn)行結(jié)果的填報(bào)。

2 試劑耗材

2.1 試劑

樣品水化及檢測(cè)過(guò)程中用到的培養(yǎng)基等試劑要按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）[5]，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)率、特異性以及選擇性的驗(yàn)證，配制好的培養(yǎng)基及試劑要在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)使用。特別需要注意的是涂布用的Baird-Parker瓊脂平板在制備凝固后，應(yīng)放在超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)皿蓋，開(kāi)啟風(fēng)機(jī)，吹風(fēng)2～

4 h，讓平板盡量干燥，加入樣液后也才能更好地吸收[6]。不符合標(biāo)準(zhǔn)要求或者使用過(guò)期的試劑和培養(yǎng)基等都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的偏離。

2.2 耗材

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)過(guò)程中使用的耗材包括無(wú)菌袋或者無(wú)菌瓶、吸管或者吸頭、試管、平皿、涂布棒和接種環(huán)等。這些耗材中一次性使用的包括無(wú)菌袋、塑料吸管、吸頭、平皿、涂布棒及接種環(huán)等，在生產(chǎn)過(guò)程中已經(jīng)過(guò)化學(xué)或者物理方式的消毒滅菌處理，并且在出廠銷(xiāo)售前經(jīng)過(guò)消毒劑殘留分解的過(guò)程，但是檢驗(yàn)員在接收到這類(lèi)耗材時(shí)，仍然需要對(duì)其進(jìn)行消毒劑殘留抑菌驗(yàn)證以及無(wú)菌驗(yàn)證，以防止使用消毒劑殘留超標(biāo)或者非無(wú)菌的耗材造成能力驗(yàn)證結(jié)果的偏離。對(duì)于非一次性耗材，如無(wú)菌瓶、玻璃吸管、玻璃試管、玻璃平皿及玻璃涂布棒等，每次使用完成后，應(yīng)清洗晾干，以備下次使用。使用這類(lèi)耗材時(shí)需要注意的是，在清洗過(guò)程中是否使用洗滌劑，清洗過(guò)程是否刷洗干凈，如果使用洗滌劑之后沒(méi)有用清水涮洗干凈，若存在洗滌劑的殘留，在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致最終檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏離。

3 操作過(guò)程

3.1 樣品的水化

樣品的水化過(guò)程應(yīng)該嚴(yán)格按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)的要求進(jìn)行操作，主要過(guò)程包括溶解、反復(fù)清洗西林瓶及回收清洗液。水化過(guò)程是整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的第一個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)最終的檢測(cè)結(jié)果有較大影響，加樣品水化所用的稀釋劑種類(lèi)和體積是否正確，樣品是否完全溶解水化，水化后的溶液是否完全轉(zhuǎn)移，樣品在水化后是否充分混合均勻，樣品水化完成后是否立即按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢測(cè)等，這些過(guò)程中的任何不規(guī)范操作都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的偏離。

3.2 樣品的稀釋過(guò)程

對(duì)于液體樣品，在稀釋過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)要求首先取25 mL樣品原液，加入225 mL稀釋劑中混合均勻，制成1∶10的樣品勻液，再?gòu)?∶10的樣品勻液中取1 mL注入盛有9 mL稀釋劑的試管中混合均勻，制成1∶100的樣品勻液，按照上述1+9這樣的操作程序繼續(xù)操作，制成1∶1 000、1∶10 000等10倍系列稀釋樣品勻液。對(duì)于定量檢測(cè)，系列稀釋過(guò)程對(duì)于檢測(cè)結(jié)果有著非常重要的影響，個(gè)別檢驗(yàn)員可能認(rèn)為同樣是10倍稀釋?zhuān)诘谝淮蜗♂寱r(shí)就直接取1 mL樣品原液注于盛有9 mL稀釋劑的試管中制成1∶10的樣品勻液，但是在檢測(cè)過(guò)程中，取樣量越大，代表性也越強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果也越準(zhǔn)確，所以取

1 mL樣品原液進(jìn)行系列稀釋的非標(biāo)準(zhǔn)操作也會(huì)造成結(jié)果的偏離。

3.3 樣品接種

接種過(guò)程是否按照標(biāo)準(zhǔn)要求取1 mL樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量進(jìn)行加樣，涂布過(guò)程是否均勻涂布整個(gè)平板，涂布過(guò)程中涂布棒是否觸及平板邊緣。加樣量錯(cuò)誤、涂布不均勻或者涂布時(shí)觸及平板邊緣也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏離。

3.4 培養(yǎng)

平板倒置培養(yǎng)前，需要注意平板上的樣液是否被完全吸收，如果樣液未被完全吸收，倒置后未被吸收的樣液可能會(huì)流出平板，最終導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。培養(yǎng)過(guò)程中的溫度和培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)是否按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，不符合要求的培養(yǎng)溫度和時(shí)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌落不能正常生長(zhǎng)或菌落形態(tài)不夠典型，從而導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果的偏離。

3.5 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)

標(biāo)準(zhǔn)中描述了金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板和血平板上的各種形態(tài)特征，要求選擇Baird-Parker平板上有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20～200 CFU的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)，從典型菌落中至少選取5個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。鑒定試驗(yàn)包括染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)以及血平板培養(yǎng)菌落形態(tài)觀察。這個(gè)過(guò)程中包括典型菌落的辨別、計(jì)數(shù)及鑒定。是否能夠正確地識(shí)別典型菌落和可疑菌落的形態(tài)，是否按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，進(jìn)行鑒定試驗(yàn)的可疑菌落形態(tài)是否具有代表性，染色鏡檢試驗(yàn)使用的培養(yǎng)物是否新鮮和染色操作步驟是否正確，血漿凝固酶試驗(yàn)是否使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽(yáng)性和陰性對(duì)照試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程中是否在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行觀察，觀察過(guò)程中是否輕拿輕放，血平板上菌落形態(tài)的觀察是否正確。這個(gè)環(huán)節(jié)也是樣品檢測(cè)過(guò)程中重要的一步，尤其是對(duì)于加有干擾菌的樣品，干擾菌的存在會(huì)影響檢驗(yàn)員對(duì)可疑菌落的辨認(rèn)和計(jì)數(shù)，從而造成結(jié)果的偏離。

3.6 結(jié)果計(jì)算和報(bào)告

標(biāo)準(zhǔn)中描述了共計(jì)5個(gè)類(lèi)別的計(jì)數(shù)形式和2個(gè)計(jì)算公式。在這一步中檢驗(yàn)員首先需要識(shí)別清楚平板計(jì)數(shù)的結(jié)果應(yīng)該屬于5個(gè)類(lèi)別計(jì)數(shù)形式的哪一種，然后按照該類(lèi)別的要求使用相應(yīng)的計(jì)算公式進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，最終按照標(biāo)準(zhǔn)要求報(bào)告結(jié)果，如果檢驗(yàn)員對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的該部分不能完全理解，則不能正確地選擇計(jì)數(shù)形式和計(jì)算公式，從而造成結(jié)果的偏離。

4 儀器設(shè)備

金黃色葡萄球菌定量檢驗(yàn)過(guò)程中使用的關(guān)鍵設(shè)備主要有高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、干熱滅菌箱，這3種設(shè)備都屬于溫控設(shè)備，需要對(duì)其進(jìn)行溫度的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和均勻性的設(shè)備性能驗(yàn)證，不符合標(biāo)準(zhǔn)要求的設(shè)備。例如高壓滅菌鍋可能會(huì)造成鍋內(nèi)培養(yǎng)基等試劑的過(guò)度滅菌或者滅菌不充分，不符合要求的生化培養(yǎng)箱則會(huì)造成箱內(nèi)培養(yǎng)的微生物不能正常生長(zhǎng)，不符合要求的干熱滅菌箱也會(huì)造成箱內(nèi)的器皿滅菌不夠充分或者對(duì)器皿造成破壞，最終造成結(jié)果出現(xiàn)偏離。

5 人員

從事微生物檢驗(yàn)的人員應(yīng)該具有相應(yīng)的微生物專(zhuān)業(yè)教育或培訓(xùn)經(jīng)歷，具備相應(yīng)的資質(zhì)，能夠理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)。無(wú)相應(yīng)檢驗(yàn)資質(zhì)或者能力經(jīng)驗(yàn)欠缺的人員可能對(duì)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)以及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)理解不夠充分，從而在樣品水化、系列稀釋、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)確認(rèn)及計(jì)算結(jié)果報(bào)告等過(guò)程中出現(xiàn)不規(guī)范操作，從而造成結(jié)果的偏離。

6 環(huán)境

金黃色葡萄球菌屬于致病菌，而能力驗(yàn)證定量檢驗(yàn)樣品中含有大量的活菌，因此實(shí)驗(yàn)中涉及活菌操作的過(guò)程應(yīng)該在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，以防對(duì)樣品、實(shí)驗(yàn)人員以及環(huán)境產(chǎn)生危害。

7 結(jié)語(yǔ)

影響金黃色葡萄球菌定量檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確性的因素主要有人員、設(shè)備、試劑、環(huán)境條件、樣品前處理和所采用的方法等。因此，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的要求，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，保證使用的儀器處于良好的工作狀態(tài)，使用的培養(yǎng)基等試劑通過(guò)驗(yàn)證，以及檢測(cè)人員具備相應(yīng)的能力等，保證能力驗(yàn)證工作獲得滿意的考核結(jié)果。

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1813501186300