從黃酒的釀造工藝上探討氨基甲酸乙酯

孫雙鴿，白衛(wèi)東，2*，錢 敏，沈 棚

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbmate，EC）又名尿烷（urethane），廣泛存在于發(fā)酵食品[1]（如醬油、腐乳等，飲料酒如黃酒、清酒、葡萄酒、蘋果酒等和蒸餾酒[2]如白蘭地、威士忌等）中，早在1943年就被提出其具有潛在致癌作用[3]，后續(xù)有眾多相關(guān)的研究報(bào)道。日本酒行業(yè)表態(tài)參照加拿大的衛(wèi)生與福利組織規(guī)定的各類酒中的EC限量，并把清酒和我國的黃酒列入加強(qiáng)酒行列中，意味著中國黃酒中EC含量應(yīng)低于100μg/L。然而EC在通常條件下穩(wěn)定性很好，尤其在酒體中一經(jīng)形成就極為穩(wěn)定，很難分解，中國黃酒中EC含量部分超標(biāo)的問題并沒有得到很好的解決。

為了弄清黃酒中氨基甲酸乙酯的來龍去脈，從黃酒的釀造工藝上探討黃酒中生成氨基甲酸乙酯的影響因素，同時(shí)，針對(duì)這些影響因素，對(duì)現(xiàn)今國內(nèi)外控制氨基甲酸乙酯含量的方法也作了介紹。

1 黃酒中氨基甲酸乙酯的形成機(jī)制

最早在葡萄酒中研究發(fā)現(xiàn)，焦碳酸二乙酯和氨可以反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯[4]，但因焦碳酸二乙酯是一種添加劑，并非酒中EC形成的主要途徑，雖然氰化物與乙醇的反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯[5]是葡萄酒中的主要途徑，但因黃酒與葡萄酒釀造原料及釀造工藝的不同，葡萄酒中的氰化物在糯米中并不存在，也不是黃酒中EC形成的主要途徑。黃酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途徑有如下幾方面。

1.1 由氨基甲酰磷酸和乙醇反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，已發(fā)酵和未蒸餾的酒精飲料中EC的形成絕大部分是由氨甲?；衔锱c乙醇自發(fā)反應(yīng)生成[6]，其反應(yīng)式：

H2NCO2PO3H2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+H3PO4

氨甲酰磷酸、尿素、瓜氨酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿素等都屬于氨甲?；衔?，這些物質(zhì)的醇解都會(huì)產(chǎn)生EC，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)得出EC的生成量與乙醇的濃度成正比[7]。但沈棚等[8-9]的研究發(fā)現(xiàn)，黃酒中EC的生成量與乙醇的濃度無正比關(guān)系。

1.2 由尿素和乙醇反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯

研究發(fā)現(xiàn)，黃酒和葡萄酒中絕大部分的EC是由尿素和乙醇反應(yīng)生成的，其反應(yīng)式：

H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+NH3

尿素一直作為酵母的氮源添加到發(fā)酵液中，尤其是釀造高質(zhì)量的白蘭地原酒時(shí)，為了降低影響風(fēng)味質(zhì)量的雜醇油的生成，需添加一定量的尿素或硫酸銨等無機(jī)氮源。1976年OUGH在實(shí)驗(yàn)中證明了乙醇和尿素在室溫條件下反應(yīng)72h后產(chǎn)生EC[10]，人們才開始注意到葡萄酒中存在的尿素，之后一些國家已不再準(zhǔn)許在葡萄酒生產(chǎn)中使用尿素。

1.3 由瓜氨酸和乙醇反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯

瓜氨酸是尿素循環(huán)與精氨酸代謝途徑的中間產(chǎn)物，目前普遍認(rèn)為瓜氨酸是氨基甲酸乙酯形成的前驅(qū)物，方若思等[9]也得出了影響黃酒發(fā)酵中EC形成的關(guān)鍵前體物是瓜氨酸而非尿素的結(jié)論。但也有研究結(jié)果表明，葡萄汁中氨基甲酸乙酯形成的數(shù)量并不和瓜氨酸含量呈線性關(guān)系，需進(jìn)一步研究[11]。

2 黃酒釀造中氨基甲酸乙酯的形成

釀造黃酒的工藝流程：

原料→浸米→蒸飯→攤涼→拌曲→前發(fā)酵→勾兌→后發(fā)酵→壓榨澄清→煎酒→裝壇→陳釀

在黃酒的釀造過程中，尿素、瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸是尿素循環(huán)和精氨酸脫亞氨基酶（arginine deiminase，ADI）代謝途徑的中間產(chǎn)物，是形成EC的前體物質(zhì)。沈棚等[8]對(duì)客家娘酒中的EC回歸分析發(fā)現(xiàn)，EC與尿素、瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸有顯著的相關(guān)性，且精氨酸、尿素與EC呈負(fù)相關(guān)性，鳥氨酸與EC呈正相關(guān)性，而乙醇與EC并沒有顯著的相關(guān)性。釀造工藝條件對(duì)黃酒中EC和EC前體物的影響可以從以下幾個(gè)方面探討。

2.1 原料的影響

中國黃酒和日本清酒的原料為秈米、粳米、糯米等。釀造原料中尿素的水平與原料預(yù)處理緊密相關(guān)，但釀酒用米一般都是精制米，外來尿素不易帶入。研究[12]表明，精制米中的尿素含量遠(yuǎn)低于原料米，隨著精制水平的提高，尿素的含量逐漸降低。其中精制程度達(dá)到70%～75%的米中尿素的含量是原料米的一半。當(dāng)使用流動(dòng)水清洗大米2遍后，尿素的含量也會(huì)降低50%。因此提高原料米的精制程度以及加大清洗力度都可以減少尿素含量。但同時(shí)，隨著原料預(yù)處理力度的加大，許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也會(huì)被清洗液一起帶走[13]，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失。因此原料預(yù)處理必須以工藝為基礎(chǔ)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

在各種釀造酒中，黃酒的尿素含量通常較高，常見市售黃酒中的尿素含量為15mg/L～35mg/L[14]。較高的尿素含量就有生成較高EC的可能，這就非常有必要降低黃酒中的尿素含量，從源頭上對(duì)EC進(jìn)行控制。

2.2 曲種的影響

黃酒釀造過程中的微生物主要有霉菌、酵母，乳酸菌及一些有害雜菌，其中霉菌包括曲霉、根霉、紅曲霉等。霉菌或者酵母都屬于真菌，其尿素循環(huán)途徑和乳酸菌的ADI途徑的中間產(chǎn)物，是合成EC的前體物質(zhì)。

發(fā)酵酒中90%的EC是由尿素與乙醇反應(yīng)生成的[6]，尿素的濃度顯著影響發(fā)酵酒中EC含量的高低。因此為了降低EC的形成，從根本上來講就是要減少尿素的含量。而減少尿素含量在尿素循環(huán)方面有4個(gè)途徑[15]：一是原料中蛋白質(zhì)；二是氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ，乙酰谷氨酸（acetyl glutamic acid，AGA）是此酶的變構(gòu)激活劑；三是尿素循環(huán)時(shí)，控制其中間產(chǎn)物的代謝，尿素循環(huán)的中間產(chǎn)物（如鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸）的濃度均可影響尿素的合成速度；四是限速酶，精氨酸代琥珀酸合成酶在鳥氨酸循環(huán)各酶系中的活性最低，是尿素合成酶的限速酶。ADI途徑方面，從合成途徑的控制酶考慮，精氨酸脫亞胺酶，鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶，氨基甲酸激酶等。

黃酒中的尿素主要是酵母菌在代謝過程中分解精氨酸而產(chǎn)生的[16]。發(fā)酵過程中，當(dāng)?shù)孜镏泻羞^量精氨酸時(shí)，精氨酸可在酵母菌內(nèi)代謝產(chǎn)生過量的尿素，一部分尿素被利用，另一部分尿素不會(huì)立即進(jìn)行降解，當(dāng)含量積累到一定程度后，酵母菌將其從胞內(nèi)釋放到發(fā)酵液中，由此導(dǎo)致葡萄酒中尿素含量升高。日本學(xué)者[17]利用基因敲除原理構(gòu)建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，尿素不積累，但細(xì)胞生長(zhǎng)速度受到明顯抑制。

陳勝[18]從酒曲等樣品中分離得到了發(fā)酵性能穩(wěn)定且低產(chǎn)尿素、遺傳穩(wěn)定的酵母，并對(duì)其進(jìn)行紫外線與γ射線聯(lián)合誘變，得突變株遺傳性狀穩(wěn)定的酵母，將突變菌株用于實(shí)驗(yàn)室釀造酵母，比分離所得菌尿素降低51.94%，提高了黃酒釀造的安全性。

而從低產(chǎn)尿素酵母的代謝途徑入手，構(gòu)建低產(chǎn)尿素酵母有以下的研究。趙然然[19]通過切斷由精氨酸酶基因（CAR1）基因編碼的精氨酸酶，弱化精氨酸分解生成尿素，從而降低發(fā)酵醪液中的尿素含量，進(jìn)而降低酒液中EC含量。朱旭亞[20]強(qiáng)化了由DUR1，2基因編碼的尿素降解途徑，采用工程菌85DUR1，2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的黃酒釀造，尿素與EC含量分別比出發(fā)菌株降低了69.88%和41.26%，室溫貯存150d，工程菌所釀酒中EC含量上升不明顯，而在發(fā)酵性能、所釀酒的酒精度、總酸及氨基酸態(tài)氮含量等指標(biāo)方面，工程菌與出發(fā)菌無顯著差異。進(jìn)行連續(xù)傳代發(fā)酵試驗(yàn)表明工程菌85DUR1，2的低產(chǎn)尿素性狀具有較好的遺傳穩(wěn)定性。由于新工藝黃酒生產(chǎn)工藝是采用純種發(fā)酵，選育產(chǎn)尿素能力差的黃酒酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，能從根本上抑制尿素的形成。多數(shù)乳酸桿菌、乳酸球菌都具有分解精氨酸、分泌瓜氨酸的能力，因此對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程的雜菌污染的控制對(duì)純種發(fā)酵的新工藝黃酒中EC的控制有一定作用。

從精氨酸代謝酶的調(diào)控作用，有研究表明，L-鳥氨酸鹽酸鹽對(duì)黃酒發(fā)酵中產(chǎn)生的致癌物EC有一定程度的抑制作用，其作用機(jī)制可能是激發(fā)胞內(nèi)鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（ornithine transcarbamoylase，OTC）活力表達(dá)，從而導(dǎo)致EC的前體物分解速度加快[21]。

趙雅敏[22]從EC降解菌入手，對(duì)具有EC降解能力的菌株進(jìn)行了篩選，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化后，活力提高了3.5倍，固定化細(xì)胞處理后EC去除率大大提高。

2.3 發(fā)酵工藝條件的影響

黃酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝[24]如麥曲釀造、高溫煎酒、長(zhǎng)時(shí)儲(chǔ)存、年份酒勾兌等都對(duì)EC的生成有直接影響。

黃酒發(fā)酵分為前發(fā)酵、主發(fā)酵和后發(fā)酵3個(gè)階段。前發(fā)酵階段主要是酵母增殖期，發(fā)酵作用弱，溫度上升緩慢。當(dāng)醅中的溶解氧基本被消耗完，酵母細(xì)胞濃度相當(dāng)高時(shí)，則進(jìn)入主發(fā)酵期，此階段酒精發(fā)酵旺盛，酒醅溫度和酒精濃度上升較快，而酒醅中的糖分逐漸減少。經(jīng)主發(fā)酵，醪液中代謝產(chǎn)物積累較多，酵母的活性變?nèi)?，即開始進(jìn)入緩慢的后發(fā)酵階段，繼續(xù)分解殘余的淀粉和糖分，發(fā)酵作用微弱，溫度逐漸降低。

根據(jù)王賓等[23]對(duì)傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵過程中精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸濃度變化規(guī)律的研究可知，乳酸發(fā)酵過程中，精氨酸含量先升高，之后開始下降，在后期階段，菌落開始大量分解精氨酸。瓜氨酸的含量則在發(fā)酵了一段時(shí)間之后開始升高，但是相對(duì)增加較少，在酒化階段，瓜氨酸、精氨酸含量都是先升高后降低。鳥氨酸濃度在酒化階段和糖化階段都是穩(wěn)步升高的。而根據(jù)尿素循環(huán)，控制精氨酸含量能直接減少尿素的含量，從而降低EC含量。掌握尿素的中間產(chǎn)物EC的前體物質(zhì)的規(guī)律，能為有效的控制EC的含量提供指導(dǎo)。

而在葡萄酒發(fā)酵中，溫度越高發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中的EC含量也越高。適宜的酒精發(fā)酵溫度一方面可以加快酵母代謝精氨酸產(chǎn)生尿素的反應(yīng)，更重要的是發(fā)酵溫度越高，尿素和乙醇反應(yīng)生成EC的速率越快。有研究報(bào)道，溫度每上升5℃，EC的生成量可提高一倍[24]。黃酒與葡萄酒雖然發(fā)酵工藝有差別，但是EC的生成量受環(huán)境影響是一致的，控制黃酒的發(fā)酵溫度，能減少EC的生成量。

釀造及貯存工藝等條件也會(huì)影響前體物質(zhì)尿素等氨甲酰類物質(zhì)的含量，從而對(duì)發(fā)酵酒中最終EC濃度產(chǎn)生影響。發(fā)酵溫度及陳釀過程中的通風(fēng)量會(huì)影響酒液中的尿素含量[22]。然而，生產(chǎn)工藝條件對(duì)酒體風(fēng)味、酒體風(fēng)格有直接影響，故相對(duì)而言，黃酒生產(chǎn)企業(yè)對(duì)工藝條件的調(diào)整也大多持審慎態(tài)度。

2.3.1 勾兌的白酒對(duì)EC的影響

客家黃酒的釀造中要在拌曲一周左右添加白酒以終止糖化，乙醇是EC生成的前體物之一，此時(shí)添加的白酒其酒精度對(duì)成品黃酒中EC的含量也有一定的影響。但對(duì)此影響，目前還沒有人進(jìn)行研究。

2.3.2 后酵對(duì)EC的影響

后酵主要進(jìn)行黃酒風(fēng)味物質(zhì)的沉積，包括肽和氨基酸含氮物質(zhì)的生成以及酯類等風(fēng)味物質(zhì)的合成[25]，也是氨基甲酸乙酯緩慢生成的階段。但是此階段從工藝上控制也只能盡量降低儲(chǔ)存溫度，最多的研究是添加酶來抑制或者去除氨基甲酸乙酯。

（1）添加酸性脲酶

在后酵的過程中，可以添加酸性脲酶來分解尿素，以對(duì)EC的形成進(jìn)行控制。

脲酶（urease）又稱尿素氨基水解酶，在自然界中普遍存在，其可以催化尿素分解生成氨與碳酸。

因黃酒壓榨后，還有勾兌澄清與煎酒的過程，在勾兌后的成品酒中添加脲酶，經(jīng)一定時(shí)間處理后在煎酒時(shí)利用高溫（90℃～92℃）破壞脲酶的殘余活力。該方法不影響黃酒正常的生產(chǎn)工藝。

脲酶的添加量和作用溫度是尿素分解率高低的主要原因，除此之外酒液的pH值、乙醇含量、蘋果酸和氟化物的含量對(duì)尿素酶的分解效果都有一定的影響。隨著脲酶添加量的增加以及作用溫度的不斷升高，尿素分解率迅速提高。周建弟等[26]對(duì)酸性脲酶在不同的溫度、用量、時(shí)間及酒體pH值下分解黃酒中尿素的酶解特性進(jìn)行了研究，表明在適宜的條件下，添加酸性脲酶可有效除去黃酒中約80%的尿素。

飲料酒通常為酸性，因此酸性脲酶才能起作用。關(guān)于酒用酸性脲酶，目前國外研究較多，早在1990年FUJINAWA S[27]等就將酸性脲酶成功應(yīng)用于葡萄酒中。2001年兒玉成一等[28]證明了采用酸性脲酶降低葡萄酒中EC含量的有效性與可行性。繼葡萄酒中脲酶的研究后，中國黃酒中脲酶的研究陸續(xù)展開，近幾年也有所突破，2008年楊魯強(qiáng)[29]對(duì)酸性脲酶進(jìn)行制備、純化，尿素的去除率達(dá)到83%；2009年王松華[30]對(duì)一株產(chǎn)酸性脲酶細(xì)菌進(jìn)行了生理生化及分子生物學(xué)鑒定，所產(chǎn)酸性脲酶在黃酒中24h的尿素去除率也達(dá)到65.2%，并且初步認(rèn)為是大腸桿菌屬細(xì)菌中一種未報(bào)道的脲酶蛋白；2012年呂園園[31]將殼聚糖-明膠復(fù)合固定化酸性脲酶酶膜以卷式膜形式，放入層析柱中制做成酶膜反應(yīng)器，黃酒中尿素去除率達(dá)54.8%，氨基甲酸乙酯含量降低率達(dá)55.6%，且未改變黃酒風(fēng)味和黃酒中的多酚含量。

添加酸性脲酶不需要換酵母菌，不改變生產(chǎn)工藝條件和原酒風(fēng)味特性，并且使用簡(jiǎn)單、見效快。在各釀造酒中，黃酒尿素的含量通常較高，因此，此方法對(duì)中國黃酒更為適用。能產(chǎn)生比較穩(wěn)定的酸性脲酶的微生物是發(fā)酵乳桿菌。由于中國黃酒特有的復(fù)雜組分，適合其他酒種的酸性脲酶，不一定很適合中國黃酒中的應(yīng)用。目前，來自乳酸菌的酸性脲酶已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。但我國脲酶的生產(chǎn)還未形成產(chǎn)業(yè)化，國內(nèi)企業(yè)使用的脲酶主要依靠進(jìn)口，脲酶純度低是阻礙我國脲酶產(chǎn)業(yè)化的主要原因之一。

（2）添加酸性EC酶

EC酶即是能直接降解EC的酶，此方法降解EC方便快捷。關(guān)于EC降解酶，從1989年開始即陸續(xù)有報(bào)道，但這些EC酶通常不耐酸和醇，耐酸、耐醇的EC酶也因?yàn)槠鋵?duì)EC的親和力很低，不適于酒精飲料。已知可以作為酒用的EC酶來自葡萄糖酸桿菌、黃桿菌[32]、地衣芽孢桿菌[33]等，陳堅(jiān)等[34]有報(bào)道產(chǎn)酸克雷伯氏菌可以產(chǎn)成黃酒用氨基甲酸乙酯酶。

2.3.3 煎酒條件的影響

把澄清后的生酒加熱煮沸片刻，殺滅其中所有的微生物，破壞酶的活性，改善酒質(zhì)，提高了黃酒穩(wěn)定性，便于貯存、保藏，這一操作過程稱滅菌，俗稱煎酒。

黃酒具有獨(dú)特的高溫（85℃左右）煎酒工序，煎酒對(duì)黃酒的穩(wěn)定性和香氣形成具有重要作用。煎酒溫度高，能使黃酒的穩(wěn)定性提高，但酒液中的尿素和乙醇會(huì)隨著煎酒溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)而加速形成更多的EC[14]。經(jīng)煎酒生成的EC，對(duì)在終端進(jìn)行黃酒中EC含量的控制，提出了特殊的需求。因此，在不影響黃酒風(fēng)味前提下，應(yīng)適當(dāng)降低煎酒溫度和減少煎酒時(shí)間。日本清酒僅在60℃時(shí)滅菌2min～3min，比黃酒低得多。降低煎酒溫度還能減少酒精成分揮發(fā)損失，減少糖和氨基化合物反應(yīng)生成的色素物質(zhì)，焦糖含量。因此在保證微生物被殺滅的前提下應(yīng)適當(dāng)降低煎酒溫度。目前各酒廠的煎酒溫度普遍在85℃～95℃。各生產(chǎn)廠家都憑經(jīng)驗(yàn)掌握煎酒時(shí)間，沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.4 陳釀條件的影響[14]

中國黃酒的儲(chǔ)存多在自然條件下，經(jīng)適當(dāng)儲(chǔ)存后酒質(zhì)改善，且對(duì)黃酒香氣口感的提高具有較大作用，而貯酒時(shí)間的延長(zhǎng)也伴隨著EC含量的增加。經(jīng)儲(chǔ)存后的黃酒中已生成一定量的EC，這部分EC也同樣對(duì)在終端進(jìn)行黃酒中EC的控制，提出了特殊需求。適當(dāng)降低儲(chǔ)酒溫度，對(duì)控制EC的含量是有利的。

2.4 直接減除技術(shù)

EC直接去除方面很少有人研究，能直接去除EC也是個(gè)好方法，其難點(diǎn)在于專一的去除EC，同時(shí)能很好的保持酒的風(fēng)味。

劉俊等[35]對(duì)各種吸附性材料中優(yōu)選得特異性功能樹脂材料L2、L3，復(fù)配后以添加量10%（v/v）處理酒樣，對(duì)黃酒中的EC去除率在60%以上，基本達(dá)到EC限量要求，同時(shí)對(duì)酒體風(fēng)味的保持較好。

3 小結(jié)與展望

黃酒中氨基甲酸乙酯的研究目前還在發(fā)展階段，EC含量與瓜氨酸、精氨酸、尿素、乙醇的相關(guān)性各研究人員各執(zhí)一詞。借鑒國外控制酒類飲料中EC含量的方法，找出適合中國黃酒的微生物、酶、工藝條件等控制EC含量的途徑仍在研究中，而控制最直接、最簡(jiǎn)便、最廉價(jià)，并且適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的方法目前看來仍是路長(zhǎng)漫漫。不過隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、在研究人員的不斷努力下，一定可以采取措施將黃酒中EC的含量控制在最低值，并且出臺(tái)中國黃酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)，以保證人民身體健康，將中華民族黃酒文化繼續(xù)傳承下去。

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