基于CRISPR/Cas9的獼猴桃性狀改良：精準(zhǔn)育種策略與挑戰(zhàn)

摘 要：" 基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展為獼猴桃（Actinidia spp.）的精準(zhǔn)育種提供了革命性工具。該文系統(tǒng)綜述了CRISPR/Cas9技術(shù)在獼猴桃性狀改良中的多維應(yīng)用及其策略與挑戰(zhàn)。基于高質(zhì)量基因組資源（如中華獼猴桃端粒到端粒無間隙參考基因組）與高效遺傳轉(zhuǎn)化體系（如無標(biāo)記農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)），研究者在果實(shí)品質(zhì)、抗病性及株型調(diào)控等領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展：通過靶向編輯AcNAC1、bZIP及MYB/bHLH復(fù)合體等關(guān)鍵基因，實(shí)現(xiàn)了檸檬酸含量降低、維生素C合成增強(qiáng)與花青素積累優(yōu)化；采用宿主-病原體雙向策略，強(qiáng)化AcCBL3介導(dǎo)的草酸鈣屏障，并干擾病原菌hopAI1毒力基因，顯著提升抗病效率；通過敲除CEN-like、AcFLC-like基因，創(chuàng)制出緊湊株型與非冷依賴萌芽新種質(zhì)。采后生理研究揭示了乙烯信號(hào)通路與細(xì)胞壁降解酶系的協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為延長(zhǎng)貨架期提供分子靶標(biāo)。盡管多倍體編輯復(fù)雜性及轉(zhuǎn)基因監(jiān)管爭(zhēng)議仍然存在挑戰(zhàn)，但多組學(xué)整合與合成生物學(xué)工具的介入，正推動(dòng)著獼猴桃育種從單基因操作向代謝通路重編程跨越。隨著全球?qū)o外源DNA編輯品種的政策松綁，基于CRISPR/Cas9的獼猴桃分子設(shè)計(jì)育種將迎來產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要機(jī)遇期。此外，該文還進(jìn)一步探討了技術(shù)優(yōu)化路徑與未來研究方向，為加速獼猴桃突破性品種選育提供了理論框架。

關(guān)鍵詞： 獼猴桃育種， CRISPR/Cas9基因編輯， 全基因組測(cè)序， 分子設(shè)計(jì)育種， 果實(shí)品質(zhì)改良

中圖分類號(hào)：" Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1000-3142（2025）03-0438-12

Kiwifruit trait improvement via CRISPR/Cas9：Precision breeding strategies and challenges

ZHU Rongxiang1， LIU Yuhong2， LI Jiewei1， YE Kaiyu1， LIU Cuixia1， XIA Liming1，GONG Hongjuan1， QI Beibei1， GAO Jianyou1， JIANG Qiaosheng1， WANG Faming1*

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Plant Functional Phytochemicals and Sustainable Utilization， Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China;

2. Guilin Agricultural Science Research Center， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：" The rapid advancement of gene editing technologies has revolutionized precision breeding in kiwifruit （Actinidia spp.）. This review systematically summarizes the multidimensional applications， strategies， and challenges of CRISPR/Cas9 technology in kiwifruit trait improvement. Leveraging high-quality genomic resources， such as the telomere-to-telomere gapless reference genome of A. chinensis， and efficient genetic transformation systems like marker-free Agrobacterium-mediated methods， researchers have achieved breakthroughs in fruit quality， disease resistance， and plant architecture regulation. Key advancements include： targeted editing of AcNAC1， bZIP and MYB/bHLH complexes to reduce citrate content， enhance vitamin C biosynthesis， and optimize anthocyanin accumulation; a host-pathogen dual-targeting strategy that strengthens the AcCBL3-mediated calcium oxalate barrier and disrupts the hopAI1 virulence gene in pathogens， significantly improving disease resistance; and knockout of CEN-like and AcFLC-like genes to develop compact plant architecture and non-cold-independent budbreak germplasms. Postharvest studies have elucidated synergistic regulatory networks between ethylene signaling and cell wall hydrolases， offering molecular targets for shelf-life extension. Despite challenges such as polyploid editing complexity and transgenic regulatory controversies， the integration of multi-omics and synthetic biology tools is advancing kiwifruit breeding from single-gene manipulation to metabolic pathway reprogramming. With global regulatory relaxation for foreign DNA-free edited varieties， CRISPR/Cas9-based molecular design breeding will usher in an important opportunity period of industrial development. In addition， this review further outlines technical optimization pathways and future research priorities， providing a theoretical framework for accelerating the breakthrough breeding of kiwifruit cultivars.

Key words： kiwifruit breeding， CRISPR/Cas9 gene editing， whole genome sequencing， molecular design breeding， fruit quality improvement

獼猴桃（Actinidia spp.）作為典型的多年生藤本果樹，其果實(shí)因獨(dú)特的風(fēng)味特征和突出的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而成為全球重要的商品化水果。然而，獼猴桃的遺傳改良長(zhǎng)期面臨多種生物學(xué)挑戰(zhàn)：其一，高度雜合的基因組特性（染色體基數(shù)x=29，存在二倍體至十倍體種質(zhì)）導(dǎo)致性狀遺傳規(guī)律復(fù)雜（Han et al.， 2023; Yu et al.， 2025）；其二，童期長(zhǎng)達(dá)3年至6年，顯著延緩育種進(jìn)程（Ferguson amp; Huang， 2007）；其三，潰瘍病等生物脅迫與氣候變化導(dǎo)致的非生物脅迫交互影響，威脅產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展（Gao et al.， 2025）。雖然傳統(tǒng)雜交育種已取得系列成果，但由于種質(zhì)資源匱乏和表型選擇效率低下，因此難以滿足市場(chǎng)對(duì)果實(shí)品質(zhì)、抗逆性和栽培適應(yīng)性的多維需求。基因編輯技術(shù)的突破為果樹育種提供了跨越式發(fā)展機(jī)遇。CRISPR/Cas9系統(tǒng)憑借其精準(zhǔn)性、高效性和多靶點(diǎn)編輯能力，在木本作物中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：通過靶向關(guān)鍵功能基因可實(shí)現(xiàn)性狀的定向改良，同時(shí)避免外源基因插入引發(fā)的生物安全爭(zhēng)議。全球主要農(nóng)業(yè)國(guó)家加速建立基因編輯作物的分類管理制度，其中日本、巴西、澳大利亞等14個(gè)國(guó)家已明確對(duì)無外源DNA的編輯植株實(shí)施與傳統(tǒng)育種品種等同的監(jiān)管政策（Entine et al.， 2021），這為獼猴桃分子設(shè)計(jì)育種的產(chǎn)業(yè)化提供了制度保障。

當(dāng)前研究急需解決的核心科學(xué)問題在于：建立適配獼猴桃生物學(xué)特性的基因編輯技術(shù)體系，解析復(fù)雜農(nóng)藝性狀的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及實(shí)現(xiàn)多性狀協(xié)同改良的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)。本文系統(tǒng)綜述CRISPR/Cas9技術(shù)在獼猴桃育種中的最新研究進(jìn)展，重點(diǎn)探討基因組資源建設(shè)、性狀改良策略和技術(shù)轉(zhuǎn)化路徑之間的協(xié)同關(guān)系。通過整合多組學(xué)數(shù)據(jù)與合成生物學(xué)工具，揭示從基因編輯到表型輸出的調(diào)控規(guī)律，為加速獼猴桃突破性品種選育提供理論框架和技術(shù)路線。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)演進(jìn)及其在果樹中的適用性

CRISPR/Cas9技術(shù)起源于細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其技術(shù)成熟與應(yīng)用拓展經(jīng)歷了多個(gè)關(guān)鍵發(fā)展階段（圖1）。1987年，科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)CRISPR（規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列），但其功能直至2005—2007年才被揭示：CRISPR包含病毒序列，并依賴Cas基因?qū)崿F(xiàn)免疫防御；CRISPR-Cas被證實(shí)為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫機(jī)制，為后續(xù)基因編輯技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)（Barrangou et al.， 2007）。Jinek等（2012）研究確認(rèn)CRISPR-Cas9是RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，通過crRNA：tracrRNA雙鏈引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶向DNA雙鏈斷裂，標(biāo)志著其正式成為高效基因編輯工具，這一機(jī)制如圖2所示（Wang T et al.， 2019）。2013年，該技術(shù)首次成功應(yīng)用于人類細(xì)胞（Cong et al.， 2013），開啟了精準(zhǔn)基因組編輯的新紀(jì)元。此后，技術(shù)持續(xù)迭代：2013—2015年，開發(fā)堿基編輯（BE）（Komor et al.， 2016）；2016—2018年，推進(jìn)先導(dǎo)編輯（PE）及CRISPR-Cas13系統(tǒng)（Anzalone et al.， 2019）；2019—2020年，CRISPR-Cas9獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)（Doudna amp; Charpentier， 2014）；2022年后，更聚焦于遞送系統(tǒng)優(yōu)化和植物基因編輯應(yīng)用（Javaid et al. 2022）。

CRISPR/Cas9技術(shù)在果樹中的適用性得益于其精準(zhǔn)性、多靶點(diǎn)編輯能力以及對(duì)復(fù)雜基因組的適應(yīng)性，該技術(shù)已成功應(yīng)用于柑橘、葡萄、蘋果、獼猴桃等果樹。例如，通過編輯柑橘CsLOB1基因，顯著增強(qiáng)其對(duì)潰瘍病的抗性（Zhou et al.， 2020; Ma et al.， 2023）；在葡萄中靶向MLO基因，提高霉菌抗性，并優(yōu)化分枝結(jié)構(gòu)（Wan et al.， 2020）；而蘋果MdTFL1基因的編輯使開花時(shí)間提前，縮短育種周期（Charrier et al.， 2019）。在獼猴桃中，基因編輯體系的建立得益于其遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。例如，Li PW等（2024）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成功編輯了與鈣草酸晶體形成相關(guān)的AeCBL3基因，為獼猴桃基因功能研究提供了高效工具。在技術(shù)優(yōu)化方面，基于CRISPR的堿基編輯器（base editor）和先導(dǎo)編輯器（prime editor）已在蘋果、柑橘中實(shí)現(xiàn)單核苷酸精準(zhǔn)替換。例如，通過胞嘧啶脫氨酶融合Cas9n（D10A）在蘋果MdPG1位點(diǎn)引入無痕突變，降低果實(shí)軟化速率（Ma et al.， 2023）；此外，Wang等（2018）通過優(yōu)化雙sgRNA/Cas9表達(dá)盒，顯著提高了獼猴桃多基因編輯效率，為復(fù)雜性狀的協(xié)同改良奠定了基礎(chǔ)。

2 獼猴桃基因組資源與CRISPR/Cas9應(yīng)用的基礎(chǔ)

獼猴桃基因組的解析是CRISPR/Cas9技術(shù)精準(zhǔn)應(yīng)用的前提。近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的突破和組學(xué)數(shù)據(jù)的積累，獼猴桃基因組資源已形成多層次、多物種的完整體系，為基因功能研究和編輯靶點(diǎn)挖掘提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

Huang等（2013）首次報(bào)道了獼猴桃的基因組草圖，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)；Wu等（2019）利用PacBio HiFi測(cè)序技術(shù)和Hi-C技術(shù)對(duì)中華獼猴桃進(jìn)行重新測(cè)序和組裝，獲得了高質(zhì)量的基因組序列。隨后，Xia等（2023）對(duì)自然二倍體美味獼猴桃（Actinidia chinensis var. deliciosa）進(jìn)行了染色體尺度組裝，發(fā)現(xiàn)與果實(shí)硬度相關(guān)的果膠代謝基因簇（如PME和PG）的拷貝數(shù)變異，為果實(shí)質(zhì)地改良提供了靶點(diǎn)。Yue等（2023）進(jìn)一步完成了中華獼猴桃的端粒到端粒（T2T）無間隙組裝，解決了著絲粒和端粒等復(fù)雜區(qū)域的序列空缺問題，顯著提升CRISPR/Cas9靶向設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。Yao等（2022）對(duì)毛花獼猴桃（A. eriantha）的全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其特有的抗?jié)儾∠嚓P(guān)基因（如NBS-LRR家族）在馴化過程中部分丟失，提示可通過CRISPR/Cas9重新引入這些基因，以增強(qiáng)栽培品種的抗性。Yu等（2023）通過全基因組測(cè)序研究了兩個(gè)獼猴桃物種毛花獼猴桃

（A. eriantha）和長(zhǎng)葉獼猴桃（A. hemsleyana）之間的生殖隔離機(jī)制，包括染色體倒位和基因家族的變化，為利用基因編輯打破生殖隔離、拓寬遺傳多樣性提供了理論依據(jù)。

此外，還有多種其他獼猴桃種類或品種完成了高水平全基因組測(cè)序，如‘Red5’獼猴桃（A. chinensis）（Pilkington et al.， 2018）、毛花獼猴桃（A. eriantha）（Tang et al.， 2019; Yao et al.， 2022; Liao et al.， 2023; Wang et al.， 2023）、六倍體美味獼猴桃（A. deliciosa）（Liu YB et al.， 2024）、‘東紅’獼猴桃（A. chinensis）（Han et al.， 2023）、闊葉獼猴桃（A. latifolia）（Han et al.， 2023）、軟棗獼猴桃（A. arguta）（Lu et al.， 2024; Zhang et al.， 2024）、長(zhǎng)葉獼猴桃（A. hemsleyana）（Yu et al.， 2023）、浙江獼猴桃（A. zhejiangensis）（Yu et al.， 2023）、山梨獼猴桃（A. rufa）（Akagi et al.， 2023; Li XL et al.， 2024）、葛棗獼猴桃（A. polygama）（Akagi et al.， 2023; Li XL et al.， 2024）、長(zhǎng)果獼猴桃（A. longicarpa）（Li XL et al.， 2024）、大籽獼猴桃（A. macrosperma）（Li XL et al.， 2024）、網(wǎng)脈獼猴桃（A. reticulata）（Li XL et al.， 2024）和黑蕊獼猴桃（A. melanandra）（Hemara et al.， 2025）等。此外，Yu等（2025）利用8個(gè)獼猴桃物種的15個(gè)高質(zhì)量基因組組裝生成了獼猴桃泛基因組。越來越多的高質(zhì)量獼猴桃全基因組測(cè)序的完成及其功能基因挖掘?yàn)镃RISPR/Cas9基因編提供了豐富的靶點(diǎn)信息。各品種/種類的相關(guān)信息詳如表1所示。

基因組資源的豐富性需與高效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)編輯應(yīng)用。Li PW等（2024）開發(fā)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)無標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，通過利用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）的Ri質(zhì)粒替代傳統(tǒng)雙元載體，成功實(shí)現(xiàn)了獼猴桃根系的穩(wěn)定編輯，并且無需抗生素篩選標(biāo)記。這一技術(shù)尤其適用于編輯與根系發(fā)育或抗逆性相關(guān)的基因（如AeCBL3）。另外，通過優(yōu)化雙sgRNA/Cas9克隆策略和表達(dá)盒，顯著提高了突變頻率和多靶點(diǎn)編輯效率（Wang et al.， 2018）。這些技術(shù)突破使得獼猴桃成為少數(shù)可實(shí)現(xiàn)高效多靶點(diǎn)編輯的多年生果樹之一。

綜上所述，獼猴桃基因組資源的系統(tǒng)化建設(shè)與編輯技術(shù)的協(xié)同創(chuàng)新，為CRISPR/Cas9驅(qū)動(dòng)的分子設(shè)計(jì)育種奠定了“從序列到表型”的全鏈條基礎(chǔ)。

3 CRISPR技術(shù)在獼猴桃果實(shí)品質(zhì)改良中的應(yīng)用

3.1 有機(jī)酸代謝調(diào)控

果實(shí)風(fēng)味是獼猴桃商品化的重要指標(biāo)，其中檸檬酸含量直接影響果實(shí)的酸甜平衡。通過CRISPR/Cas9靶向敲除NAC轉(zhuǎn)錄因子基因AcNAC1，發(fā)現(xiàn)突變體果實(shí)中檸檬酸含量顯著降低，同時(shí)伴隨乙烯合成相關(guān)基因的上調(diào)。Fu等（2023）的研究不僅揭示了AcNAC1在檸檬酸代謝中的核心作用，而且還為通過基因編輯定向調(diào)控果實(shí)風(fēng)味提供了范例。此外，F(xiàn)u等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，AcNAC1通過調(diào)控甲硫氨酸磺氧化物還原酶（MSR）影響乙烯合成，表明CRISPR/Cas9技術(shù)可用于解析復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的級(jí)聯(lián)調(diào)控機(jī)制。

3.2 維生素C （抗壞血酸）合成增強(qiáng)

獼猴桃是維生素C含量最高的水果之一，其合成途徑受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。Liu等（2022）、Liu X等（2023）利用CRISPR/Cas9技術(shù)揭示了bZIP轉(zhuǎn)錄因子AcePosF21和MYBS1-like/GBF3復(fù)合體在冷脅迫下激活GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP3）表達(dá)的分子機(jī)制。通過編輯這些調(diào)控因子，可顯著提高果實(shí)中維生素C的積累量，為培育高營(yíng)養(yǎng)品種提供了新策略。

3.3 花青素合成與果肉色澤改良

紅心獼猴桃（如‘紅陽(yáng)’品種）因其獨(dú)特的果肉色澤而備受市場(chǎng)青睞。Wang LH等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，MYB/bHLH轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體通過激活花青素合成基因（如AcANS和AcF3GT1）調(diào)控果肉紅色形成。利用CRISPR/Cas9靶向編輯這些轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域，可進(jìn)一步強(qiáng)化花青素合成，甚至實(shí)現(xiàn)非紅色品種的色澤改良。此類研究為獼猴桃外觀品質(zhì)的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

4 抗病性改良：從宿主到病原體的雙向策略

4.1 宿主抗病基因的強(qiáng)化

獼猴桃潰瘍病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae， Psa）引起，是威脅全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)的毀滅性病害。傳統(tǒng)育種中抗病基因的挖掘受限于種質(zhì)資源的匱乏，而CRISPR/Cas9技術(shù)為宿主抗病性的快速改良提供了新思路。Li PW等（2024）通過編輯AeCBL3基因，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控的鈣草酸晶體在細(xì)胞壁中形成物理屏障，可顯著抑制病原菌侵染。這一發(fā)現(xiàn)揭示了植物次生代謝產(chǎn)物在抗病中的潛在作用，為通過基因編輯增強(qiáng)獼猴桃先天免疫提供了新靶點(diǎn)。此外，在紅心獼猴桃中鑒定的MYB/bHLH復(fù)合體不僅調(diào)控花青素合成，而且還參與苯丙烷代謝途徑，可能通過增強(qiáng)細(xì)胞壁木質(zhì)化間接提升抗病性（Chezem amp; Clay， 2016; Wang et al.， 2022）。

4.2 病原體毒力基因的精準(zhǔn)干擾

除了改良宿主，直接靶向病原體基因是抗病策略的另一突破。Ho（2019）首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入Psa病原體，并成功構(gòu)建了攜帶活性CRISPR-Cas9系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒。隨后，利用該系統(tǒng)成功消除了Psa3中的質(zhì)粒p18708和整合性共軛元件Pac_ICE1，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Psa3染色體基因的靶向編輯（Ho et al.， 2020），為研究Psa的致病機(jī)制和開發(fā)新的防治策略提供了基礎(chǔ)。Liu B等（2023）進(jìn)一步優(yōu)化了這一策略，利用dCas9-BE3和dCas12a-BE3堿基編輯系統(tǒng)，在不切斷DNA雙鏈的情況下，精準(zhǔn)突變Psa的hopAI1（毒性效應(yīng)因子）基因，使70%以上的病原菌毒力降低。這種基于病原體自身基因的靶向抑制策略為開發(fā)基于CRISPR/Cas9的微生物殺菌劑提供了理論依據(jù)。

5 株型與生長(zhǎng)周期的精準(zhǔn)調(diào)控

5.1 童期縮短與開花誘導(dǎo)

獼猴桃為多年生藤本植物，其長(zhǎng)達(dá)3年至5年的童期嚴(yán)重制約育種效率。Varkonyi-Gasic等（2019）通過CRISPR/Cas9敲除CENTRORADIALIS-like（CEN-like）基因，成功將攀援型獼猴桃轉(zhuǎn)化為緊湊型植株，并誘導(dǎo)其提前開花。這一研究揭示了CEN-like基因在維持頂端優(yōu)勢(shì)中的關(guān)鍵作用，為縮短育種周期提供了革命性工具。然而，Wang等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，雖然CEN基因編輯改變株型，但對(duì)果實(shí)成熟和采后生理無顯著影響，表明基因功能的模塊化特性可被選擇性利用。最新研究通過CRISPR-Cas9編輯CEN/CEN4基因，在多個(gè)獼猴桃物種中實(shí)現(xiàn)了快速開花表型。例如，雙等位基因編輯毛花獼猴桃（A. eriantha）的CEN或CEN4后，植株在組織培養(yǎng)階段或移栽后即開花，花朵與果實(shí)形態(tài)正常；而通過靶向四倍體軟棗獼猴桃（A. arguta）所有4個(gè)等位基因，獲得了極端早花表型，其中完全突變株表現(xiàn)為極度矮化并在主枝末端開花（Herath et al.， 2023）。

5.2 休眠與萌芽的冷響應(yīng)調(diào)控

溫帶果樹的休眠解除依賴低溫積累，而氣候變化導(dǎo)致的暖冬可能擾亂這一過程。Voogd等（2022）鑒定到一個(gè)與擬南芥FLC同源的MADS-box的基因AcFLC-like，其表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，并通過表觀遺傳修飾（如組蛋白H3K27me3去甲基化）調(diào)控萌芽時(shí)間。通過CRISPR/Cas9編輯該基因的啟動(dòng)子區(qū)域，可打破其低溫依賴性，使獼猴桃在非最適氣候下仍能正常萌芽，為應(yīng)對(duì)氣候變化提供了適應(yīng)性解決方案。同時(shí)，研究表明獼猴桃的BFT基因在調(diào)控生長(zhǎng)停止和休眠方面具有重要作用。通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的BFT基因誘變，產(chǎn)生了植株呈現(xiàn)出持續(xù)生長(zhǎng)的表型，這些植株延遲了生長(zhǎng)停止和落葉時(shí)間，并在落葉后提前萌芽，揭示了BFT基因在獼猴桃休眠和萌芽調(diào)控中的重要作用（Herath et al.， 2022），為進(jìn)一步理解獼猴桃的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供了重要的依據(jù)。

6 果實(shí)成熟與采后貯藏的分子設(shè)計(jì)

6.1 乙烯合成與信號(hào)通路的調(diào)控

獼猴桃為典型的呼吸躍變型果實(shí)，乙烯是調(diào)控其成熟的核心因子。NAC轉(zhuǎn)錄因子通過激活甲硫氨酸磺氧化物還原酶（AcMSR）調(diào)控甲硫氨酸代謝，進(jìn)而影響乙烯合成。通過CRISPR/Cas9敲低AcMSR，可延緩果實(shí)軟化，并延長(zhǎng)貨架期（Fu et al.， 2021）。此外，Wang等（2021）證實(shí)，即使在高效率的CEN基因編輯株系中，乙烯通路的關(guān)鍵基因（如ACS和ACO）表達(dá)未受干擾，表明成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的獨(dú)立性。

6.2 細(xì)胞壁降解酶的靶向編輯

果實(shí)質(zhì)地軟化與多聚半乳糖醛酸酶（PG）和纖維素酶（Cel）活性密切相關(guān)。Zhou等（2020）綜述了在番茄等作物中利用CRISPR/Cas9沉默PG基因以改善耐貯性的案例，這一策略可直接遷移至獼猴桃。Ma等（2023）進(jìn)一步提出，通過多重編輯同時(shí)靶向PG、Cel和果膠甲酯酶（PME）基因，可能實(shí)現(xiàn)果實(shí)質(zhì)地的“可編程化”設(shè)計(jì)。

CRISPR技術(shù)正在驅(qū)動(dòng)獼猴桃育種的系統(tǒng)性革新。CRISPR/Cas9技術(shù)推動(dòng)了獼猴桃育種從單一性狀改良向多維度系統(tǒng)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)型。如表2所示，當(dāng)前研究已建立覆蓋果實(shí)品質(zhì)、抗病性、株型調(diào)控等關(guān)鍵農(nóng)藝性狀的基因編輯技術(shù)矩陣，并逐步揭示跨模塊調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的互作規(guī)律。通過整合基因組學(xué)、表觀遺傳調(diào)控及合成生物學(xué)工具，研究者能夠精準(zhǔn)預(yù)測(cè)多基因疊加效應(yīng)，構(gòu)建“編輯-驗(yàn)證-優(yōu)化”的閉環(huán)設(shè)計(jì)框架。這一技術(shù)體系不僅將傳統(tǒng)育種的線性迭代模式升級(jí)為并行式性狀組裝，而且還通過“編輯元件模塊化”“遞送系統(tǒng)通用化”等策略顯著提升了木本作物的育種效率。然而，多基因協(xié)同編輯的劑量效應(yīng)與生態(tài)適應(yīng)性仍是亟待突破的瓶頸，這為后續(xù)的技術(shù)優(yōu)化指明了方向。

7 技術(shù)挑戰(zhàn)與未來展望

7.1 編輯效率與脫靶效應(yīng)

盡管Wang等（2018）通過優(yōu)化sgRNA設(shè)計(jì)及Cas9表達(dá)系統(tǒng)，將獼猴桃的編輯效率提升超80%，但在實(shí)際應(yīng)用中，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。二倍體與多倍體獼猴桃的等位基因復(fù)雜性，使得編輯后表型不均一成為突出問題。多倍體獼猴桃擁有多套染色體和多個(gè)等位基因，在進(jìn)行基因編輯時(shí)，難以保證所有等位基因都被精準(zhǔn)修飾。例如，在編輯與果實(shí)甜度相關(guān)基因時(shí)，部分等位基因編輯成功可能提升甜度，而未編輯或編輯效果不佳的等位基因則會(huì)導(dǎo)致果實(shí)甜度參差不齊，從而影響商品價(jià)值。此外，脫靶效應(yīng)也不容忽視。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可能會(huì)在非預(yù)期位點(diǎn)進(jìn)行切割，造成非靶向基因的突變，引發(fā)一系列未知的生物學(xué)效應(yīng)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果和育種進(jìn)程。單倍體誘導(dǎo)與基因編輯結(jié)合，或許是突破這些瓶頸的有效途徑（Yao et al.， 2018; Liu CL" et al.， 2024; Nazir et al.， 2024）。以利用MTL基因編輯創(chuàng)建單倍體為例（MTL基因編碼花粉特異性磷脂酶），單倍體僅含一套染色體，能簡(jiǎn)化基因編輯過程，避免等位基因干擾，使編輯效果更易預(yù)測(cè)和分析，有助于篩選出穩(wěn)定優(yōu)良性狀的植株，從而提高育種效率。

7.2 非轉(zhuǎn)基因編輯體系的建立

目前，多數(shù)獼猴桃基因編輯研究依賴農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術(shù)，而這一方法會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因爭(zhēng)議。消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性存在疑慮，監(jiān)管政策也較為嚴(yán)格，這限制了基因編輯獼猴桃的商業(yè)化進(jìn)程。因此，開發(fā)無標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)及瞬時(shí)表達(dá)CRISPR組分（如RNP遞送）成為邁向商業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵（Chandran et al.， 2023; Li PW et al.， 2024）。無標(biāo)記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可減少篩選標(biāo)記基因在編輯植株中的殘留，從而降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)；而RNP遞送技術(shù)則是將 CRISPR/Cas9蛋白和sgRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞，避免了外源DNA整合到基因組中，有望打破轉(zhuǎn)基因爭(zhēng)議的壁壘，從而推動(dòng)基因編輯獼猴桃走向市場(chǎng)。

7.3 合成生物學(xué)與多維性狀整合

未來獼猴桃育種有望結(jié)合CRISPR/Cas9與合成生物學(xué)工具，實(shí)現(xiàn)多維性狀的整合調(diào)控。例如，將酵母的萜類合成通路引入獼猴桃，可增強(qiáng)果實(shí)香氣 （Taratynova et al.， 2024），提升其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。同時(shí)，借鑒Keul 等（2022）提出的“智能作物”概念，設(shè)計(jì)可響應(yīng)環(huán)境信號(hào)（如溫度、光照）自動(dòng)調(diào)控性狀的基因回路，能夠讓獼猴桃更好地適應(yīng)環(huán)境變化。在高溫時(shí)，啟動(dòng)耐熱基因表達(dá)；光照不足時(shí)，增強(qiáng)光合作用相關(guān)基因活性，從而提高產(chǎn)量和品質(zhì)，為培育多功能、適應(yīng)性強(qiáng)的獼猴桃新品種提供新方向。

雖然基因編輯技術(shù)在獼猴桃育種領(lǐng)域面臨挑戰(zhàn)，但也充滿希望。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新與升級(jí)，編輯效率與脫靶效應(yīng)、非轉(zhuǎn)基因編輯體系建立等問題逐步被攻克，合成生物學(xué)帶來了更多育種新思路（圖3）。獼猴桃育種將更精準(zhǔn)、更高效，有望培育出更多滿足市場(chǎng)需求的優(yōu)質(zhì)品種，從而推動(dòng)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為全球水果市場(chǎng)注入可持續(xù)發(fā)展的潛力。

8 結(jié)語(yǔ)

CRISPR/Cas9技術(shù)正在系統(tǒng)性重構(gòu)獼猴桃育種的科學(xué)范式，推動(dòng)其從單一性狀改良向多維度精準(zhǔn)設(shè)計(jì)躍遷。在基礎(chǔ)研究層面，技術(shù)革新與基因組學(xué)突破形成雙向驅(qū)動(dòng)：一方面，多順反子tRNA-sgRNA體系（PTG/Cas9）通過優(yōu)化sgRNA加工效率，將靶標(biāo)突變率提升近10倍（Wang et al.， 2018）；另一方面，多層次基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（如KGD）和端粒到端粒參考基因組的構(gòu)建（Yue et al.， 2020， 2023），為跨物種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析提供了分子導(dǎo)航圖。值得關(guān)注的是，CEN/CEN4基因編輯系統(tǒng)在二倍體至四倍體獼猴桃中實(shí)現(xiàn)持續(xù)開花表型（Herath et al.， 2023），將傳統(tǒng)5年童期壓縮至2個(gè)月（Herath et al.， 2023），為表型關(guān)聯(lián)研究奠定了基礎(chǔ)。目前，CEN4基因編輯系統(tǒng)在二倍體和四倍體獼猴桃中均實(shí)現(xiàn)持續(xù)開花（Herath et al.， 2023），為加速純合系創(chuàng)制提供了可能；而FT基因過表達(dá)與HA標(biāo)簽融合技術(shù)初步實(shí)現(xiàn)開花時(shí)間調(diào)控（Herath et al.， 2023）。這些進(jìn)展為木本果樹速效育種樹立了新標(biāo)桿。在技術(shù)應(yīng)用層面，獼猴桃基因編輯已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化前夕：通過CEN4編輯創(chuàng)制的速生種質(zhì)可實(shí)現(xiàn)多世代性狀疊加，配合監(jiān)管政策對(duì)無外源DNA編輯作物的分類管理，顯著縮短品種選育周期。而機(jī)器學(xué)習(xí)驅(qū)動(dòng)的sgRNA脫靶預(yù)測(cè)、 光控CRISPR開關(guān)等前瞻性技術(shù)， 為進(jìn)一步提升編輯精準(zhǔn)性和時(shí)空可控性儲(chǔ)備了創(chuàng)新勢(shì)能。

盡管目前仍需應(yīng)對(duì)基因流生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)、公眾認(rèn)知差異等挑戰(zhàn)，但在我國(guó)基因編輯生物安全評(píng)價(jià)體系逐步完善的政策紅利下（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2023），CRISPR驅(qū)動(dòng)的獼猴桃精準(zhǔn)育種必將重塑全球水果產(chǎn)業(yè)格局——從氣候適應(yīng)性品種的快速迭代到功能性營(yíng)養(yǎng)成分的定向強(qiáng)化，這一技術(shù)體系正在為果樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展注入強(qiáng)勁的科技動(dòng)能。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）

基金項(xiàng)目：" 廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA23023008）； 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系“廣西落葉果樹產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”項(xiàng)目（nycytxgxcxtd-2023-13-01）； 廣西植物研究所基本業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（桂植業(yè)24007）； 廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（ZRJJ2023-3）。

第一作者： 朱榮香（1993—），博士，主要從事園藝植物CRISPR基因編輯育種研究，（E-mail）zrx@gxib.cn。

*通信作者：" 王發(fā)明，博士，研究員，主要從事園藝植物分子育種研究，（E-mail）wfm_rz@163.com.