葉綠體序列和核微衛(wèi)星顯示同域分布潤楠屬物種雜交嚴(yán)重

摘 要：" 樟科潤楠屬（Machilus Nees）植物為常綠喬木，是亞熱帶常綠闊葉林常見的優(yōu)勢種，具有重要的經(jīng)濟價值，但屬內(nèi)分類和種間系統(tǒng)進化關(guān)系存在較大爭議。為了解其可能的原因，該文選擇12個同域分布的潤楠屬物種，采用72個葉綠體DNA序列片段和10個核微衛(wèi)星位點進行分析。結(jié)果表明：（1） 72個葉綠體DNA序列片段共44 025 bp的序列上僅有48個變異位點，多態(tài)性極低。（2） 10個核微衛(wèi)星標(biāo)記在12個潤楠屬物種中通用性好、多態(tài)性高，不同物種間共享大量等位基因，獨有等位基因少。（3） 基于葉綠體DNA不能得到支持率高的一致系統(tǒng)進化樹，微衛(wèi)星標(biāo)記支持建潤楠（M. oreophila）、狹葉潤楠（M. rehderi）和紅楠（M. thunbergii）的分類地位，但其他物種間關(guān)系混亂且核-質(zhì)系統(tǒng)進化關(guān)系沖突，其原因可能是種間頻繁的雜交漸滲模糊了種間的界限。后續(xù)需綜合形態(tài)學(xué)和多種分子標(biāo)記，開發(fā)有效的分析工具，以理解潤楠屬內(nèi)復(fù)雜的系統(tǒng)進化關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 潤楠屬， 葉綠體序列， 核微衛(wèi)星， 系統(tǒng)進化， 漸滲雜交

中圖分類號：" Q949

文獻標(biāo)識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2025）03-0555-12

Chloroplast sequences and nuclear microsatellites reveal extensive hybridization among sympatric species of the genus Machilus

JIANG Kai1，2， WANG Zhengwei1， CHEN Xiaoyong2*

（ 1. Eastern China Conservation Centre for Wild Endangered Plant Resources， Shanghai Chenshan Botanical Garden， Shanghai 201602，China;

2. School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200062， China ）

Abstract：" Plants of the genus Machilus Nees （Lauraceae） are evergreen trees and are common dominant species in subtropical evergreen broad-leaved forests， with significant economic value. However， there is considerable debate regarding the classification within the genus and the phylogenetic relationships among species. To explore the potential reasons behind this， this study selected 12 sympatric species of Machilus and analyzed 72 chloroplast fragments and 10 nuclear microsatellite loci. The results were as follows： （1） A total of only 48 variable sites were found across the 44 025 base pairs of the 72 chloroplast fragments， indicating extremely low polymorphism. （2） The 10 nuclear microsatellite markers showed good universality across the 12 species of Machilus， with high polymorphism， a large number of shared alleles among different species， and very few private alleles. （3） A high-support consensus phylogenetic tree could not be obtained based on chloroplast DNA， while microsatellite markers supported the taxonomic status of M. oreophila， M. rehderi， and M. thunbergii. However， those relationships among other species were confused and there was incongruence between nuclear and plastid phylogenies. This confusion is likely attributed to frequent interspecific hybridization" that have blurred the boundaries between species. Further research is needed to integrate morphological data and multiple molecular markers， and to develop effective analytical tools to understand the complex phylogenetic relationships within the genus Machilus.

Key words： Machilus， chloroplast sequence， nuclear microsatellites， phylogenetics， introgressive hybridization

潤楠屬（Machilus Nees）隸屬于樟科（Lauraceae），全球已知100余種，廣泛分布于中國的大陸和臺灣島，以及朝鮮半島、日本群島、中南半島、印度次大陸、馬來西亞、印度尼西亞和菲律賓等地。我國有82種，其中63種為我國特有（Wei et al.， 2008）。大部分潤楠屬植物為東亞熱帶、亞熱帶常綠闊葉森林的建群種，是研究生物地理的重要類群，對于理解亞熱帶常綠闊葉林的起源和演化以及生物多樣性保護具有重要意義（林夏珍，2007a， b; Zhu et al.， 2017; Jiang et al.， 2021; Fan et al.， 2022; Hu et al.， 2022; Xiao et al.， 2022）。此外，潤楠屬植物還具有重要的經(jīng)濟價值和觀賞價值，為江南四大名木——楠木的主要來源。屬內(nèi)不少物種為優(yōu)良園林觀賞植物，其樹皮和葉可制作褐色染料以及各種熏香的調(diào)和劑或飲用水的純化劑，全株可提取芳香油，種子油可作潤滑劑（Cheng et al.， 2009; Yang SS et al.， 2022; Yang SY et al.， 2022; Yang et al.， 2023; To et al.， 2023; Huong et al.， 2024）。

潤楠屬植物的準(zhǔn)確分類和鑒定是保護和可持續(xù)利用潤楠屬資源的基礎(chǔ)。形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記證據(jù)已確立潤楠屬的屬級地位（李樹剛，1982; 王玉國和韋發(fā)南，2003; 韋發(fā)南和唐賽春，2006; Rohwer et al.， 2009）。經(jīng)典形態(tài)分類系統(tǒng)依據(jù)花被片外面有無毛以及果實形狀和大小將該屬分為6個大組（李樹剛，1982）?；诖耍顦鋭偤晚f發(fā)南（1984）對我國潤楠屬進行了修訂，后韋發(fā)南等（2001）對一些潤楠屬物種進行了合并，如嘉道理楠（Persea kadooriei）=信宜潤楠（Machilus wangchiana）、長序潤楠（M. longipedunculata） = 浙江潤楠（M. chekiangensis）、密脈潤楠（M. polyneura）=刨花潤楠（M. pauhoi）等。然而，潤楠屬內(nèi)雖有一些形態(tài)特征十分相似但不易區(qū)分的物種，如華潤楠（M. chinensis）與紅楠（M. thunbergii）、絨毛潤楠（M. velutina）與黃絨潤楠（M. grijsii）等種類的葉形比較相近，常發(fā)生誤定現(xiàn)象（林夏珍，2007a，b）。因此，莊雪影（1997）、莊雪影（2002）、林夏珍（2007a，b）以及鐘義和夏念和（2010）對該屬部分物種進行孢粉學(xué)、胚胎學(xué)、葉表皮和木材結(jié)構(gòu)的比較，嘗試為潤楠屬屬下分類尋找輔助特征。然而，組內(nèi)不同物種間花粉特征存在交叉，屬內(nèi)一些組的劃分也是武斷的（湯庚國和向其柏，1995）。此外，這些研究所選材料不一致，很難將其結(jié)果進行統(tǒng)一分析。

近幾十年來，分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于物種界定和系統(tǒng)進化分析，并在潤楠屬中進行了探討。例如，陳俊秋等（2009）運用ITS序列、基于貝葉斯進化樹的分析結(jié)果表明，潤楠屬組成鱷梨屬群中一獨立分支是一個自然的單系類群，但潤楠屬內(nèi)物種分支混亂，與傳統(tǒng)植物學(xué)分類中對潤楠屬內(nèi)各組的劃分相矛盾。因此，不支持前人依據(jù)花被片外面被毛情況及果實大小所建立的潤楠屬屬下系統(tǒng)。Li等（2011）采用ITS和LEAFY序列分析鱷梨屬群的系統(tǒng)進化關(guān)系，得到類似結(jié)論。Song等（2017）基于樟科27個代表類群共47個葉綠體基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)樹，確定了樟科不同屬間的進化關(guān)系，進一步支持潤楠屬為單系類群。Xiao等（2022）使用鱷梨族（Perseeae）53個物種（包括25個潤楠屬物種）的葉綠體基因組構(gòu)建了屬級水平的系統(tǒng)進化樹，并確認潤楠屬為單系，但屬內(nèi)不同物種間分支在系統(tǒng)進化樹上的支持率仍不高。這些研究結(jié)果顯示，潤楠屬種間關(guān)系不明晰，其屬下物種系統(tǒng)進化關(guān)系復(fù)雜，還需要深入探討這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

造成潤楠屬系統(tǒng)進化關(guān)系復(fù)雜、物種難以界定的原因：可能是該屬起源較晚，物種間尚未形成明顯的系統(tǒng)進化關(guān)系；也可能是因這個屬種間雜交非常嚴(yán)重而導(dǎo)致種間形態(tài)特征相似、遺傳關(guān)系不穩(wěn)（Rohwer et al.， 2009）。因此，本研究使用72個葉綠體DNA序列片段和10對基于紅楠基因組開發(fā)出的核微衛(wèi)星位點分析同域分布的潤楠屬物種，以期了解這些物種間的進化關(guān)系，初步分析不同標(biāo)記在潤楠屬分類中的適用性，并探討造成潤楠屬種間系統(tǒng)分類困難的可能原因。

1 材料與方法

1.1 研究地點和樣品采集

我們主要以同域分布的潤楠屬物種作為研究對象，從分布于廣西壯族自治區(qū)、廣東省和湖南省的潤楠屬植物中選取了12個分布區(qū)重疊的物種用于本研究。不同物種之間的地理位置距離5～450 km不等（圖1）。這12個物種分別是華潤楠、基脈潤楠（M. decursinervis）、建潤楠（M. oreophila）、狹葉潤楠（M. rehderi）、瓊桂潤楠（M. foonchewii）、短序潤楠（M. breviflora）、粗壯潤楠（M. robusta）、薄葉潤楠（M. leptophylla）、黃絨潤楠、黔桂潤楠（M. chienkweiensis）、紅楠和刨花潤楠。它們分屬于潤楠屬5個組，即毛花組6個物種、光花組3個物種、大果組1個物種、絨毛組和滇黔桂組各1個物種。每個物種至少采集1份植物標(biāo)本，樣品用硅膠干燥處理，并保存于上海辰山植物標(biāo)本館中。

1.2 同域分布潤楠屬物種的潛在分布區(qū)模擬

為預(yù)測12個潤楠屬植物的潛在分布區(qū)，使用MaxEnt v.3.3.1軟件（Phillips amp; Dudík， 2008）中的最大熵方法來模擬當(dāng)前的分布。從科學(xué)引文索引數(shù)據(jù)庫、中國國家知識基礎(chǔ)設(shè)施、全球生物多樣性信息設(shè)施和中國虛擬植物標(biāo)本館進行搜索，獲得了12個潤楠屬物種的分布記錄。排除明顯超出自然分布范圍的記錄，并移除同一個物種中相近（48 km以內(nèi)）的記錄點。從WorldClim數(shù)據(jù)庫（http：//www.worldclim.org/）中提取當(dāng)前19個生物氣候因子數(shù)據(jù)。使用ENMtools v 1.3軟件 （Warren et al.， 2010）排除高度相關(guān)的生物氣候變量（rgt;0.7），最終保留了4個氣候變量（Bio1、Bio3、Bio16和Bio19）。我們進行20次獨立的模型交叉驗證，其中75%的數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練，剩余25%用于測試。采用特征曲線下面積（area under the curve，AUC）評估模型性能（Elith et al.， 2011）。

1.3 DNA提取和PCR擴增

稱取硅膠干燥的葉片樣品約35 mg，使用天根植物基因組提取試劑盒［DP305，天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組總DNA。潤楠屬植物多糖多酚含量較高，采用氯仿抽提2次以去除雜質(zhì)和提高DNA質(zhì)量。于4 ℃冰箱靜置1 d降解RNA，吸取3 μL DNA原液，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測。根據(jù)紅楠葉綠體基因組的長單拷貝區(qū)序列，設(shè)計了72對引物，用于潤楠屬12個物種的葉綠體DNA擴增和測序。使用Mastercycler nexus PCR擴增儀（Eppendorf， Hamburg， Germany）進行PCR擴增。將擴增條帶清晰且長度與設(shè)計的目標(biāo)片段大小相同的PCR擴增產(chǎn)物，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

根據(jù)發(fā)表的紅楠微衛(wèi)星引物（Kaneko et al.， 2012），隨機選取18對微衛(wèi)星引物序列，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。每對引物使用2個不同紅楠種群個體的基因組DNA進行溫度梯度擴增，以優(yōu)化最適退火溫度。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在Gel Doc2000TM凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD， California， USA）上拍照記錄。通過溫度梯度的方法，我們從18對引物中共篩選出10對條帶清晰且穩(wěn)定性好的引物用于后續(xù)研究（Jiang et al.， 2021）。使用這10對引物對潤楠屬12個物種的種群樣品進行擴增，每個種群擴增11～28個樣品。擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司用Applied BiosystemsTM 3730XL儀器（Thermo Fisher， the USA）進行片段掃描，獲得樣品的原始片段長度數(shù)據(jù)。隨后，我們使用GeneMarker軟件（Holland amp; Parson， 2011）對片段長度數(shù)據(jù)進行讀取和判定，確定個體的基因型。

1.4 葉綠體基因組序列數(shù)據(jù)分析

1.4.1 序列拼接及校正 使用Geneious R11軟件（https：//www.geneious.com）讀取測序獲得的原始序列峰圖，并對序列進行拼接、 手工校正序列存在的沖突位點，最終獲得一致序列。使用MAFFT v.6.240軟件（Katoh et al.， 2019），對12個物種的72個葉綠體DNA序列片段分別進行對齊。其中，59個片段完全一致，13個片段存在變異。因此，后續(xù)主要使用這13個葉綠體DNA序列片段進行分析。本研究將12個物種的13個多態(tài)葉綠體DNA序列片段首尾拼接后，獲得序列矩陣。同時，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載2個潤楠屬植物 ［滇潤楠（Machilus yunnanensis）］和銹毛潤楠（M. balansae）和5個楠屬植物 ［閩楠（Phoebe bournei）、楨楠（P. zhennan）、浙江楠（P. chekiangensis）、竹葉楠（P. omeiensis）和紫楠（P. sheareri）］的葉綠體基因組序列，并從這些基因組上提取上述13個葉綠體DNA序列片段所在區(qū)域。最終將這些序列進行首尾對齊，相連后組成一個包含19個物種10 756 bp長度的葉綠體DNA序列片段組成的序列矩陣，用于后續(xù)系統(tǒng)進化分析。

1.4.2 葉綠體DNA序列突變網(wǎng)絡(luò)分析 使用Network v.5.0軟件 （Bandelt et al.， 1999），分析葉綠體DNA序列的突變網(wǎng)絡(luò)。對于每個潤楠屬物種，將13條具多態(tài)性的葉綠體DNA片段首尾拼接成1條序列，每條序列表示1個單倍型。使用Median-Joining網(wǎng)絡(luò)算法（Weight = 10， Epsilon = 0）對這14個單倍型的突變狀態(tài)進行計算，改變Epsilon參數(shù)為10、20、30分別計算單倍型間的關(guān)系，最終獲得單倍型間的突變網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4.3 系統(tǒng)進化關(guān)系分析 使用鄰接法（neighbor joining method， NJ）和非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted paired group method using arithmetic average， UPGMA）構(gòu)建物種的系統(tǒng)進化樹，自展重復(fù)（bootstrap）1 000次。相關(guān)分析在MEGA v.10.0.5軟件中完成（Kumar et al.， 2018）。

使用MEGA軟件進行最大簡約法（maximum parsimony，MP）分析。基于啟發(fā)式搜索，隨機逐步添加物種序列，并將這些序列逐個添加到能獲得最優(yōu)樹的位置，重復(fù)這一步驟直到所有序列全部添加進來建立初始樹。在初始樹的基礎(chǔ)上使用二分樹再接法（tree bisection reconnection， TBR）中的分支交換法尋找最優(yōu)樹。使用1 000次自展重復(fù)抽樣來評估系統(tǒng)進化樹每支的支持率。

根據(jù)前面模型選擇結(jié)果確定適合本研究數(shù)據(jù)的最優(yōu)進化模型，以最大簡約樹為初始樹采用最大似然法（maximum likelihood，ML）估計模型中的參數(shù)值，并尋找似然值最大時的系統(tǒng)進化樹，使用RAxML v.8.0軟件 （Stamatakis， 2014）基于最適模型GTR+G+I進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，使用1 000次自展重復(fù)抽樣評估系統(tǒng)進化樹上每支的支持率。

使用MrBayes v.3.2軟件（Ronquist et al.， 2012）基于貝葉斯方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹?；隈R爾科夫鏈蒙特卡洛法（Markov chain Monte Carlo approach， MCMC）進行107代運算，每次運行均可得到1棵系統(tǒng)樹，每隔1 000代取樣1次。本研究將運行的前25%馬爾科夫鏈作為老化值（burn-in）丟棄，最終使用剩下的樹進行一致樹分析。使用Tracer v.1.7軟件 （Rambaut et al.， 2018）對似然值分布和有效樣本大小進行分析，以判斷各參數(shù)值是否收斂。另外，通過判斷二分樹頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)差是否小于或等于0.01來確定運行是否達到穩(wěn)態(tài)。最終以50%多數(shù)規(guī)則合一樹作為最優(yōu)樹。

1.4.4 物種分化時間推斷 選取楠屬5個物種（閩楠、楨楠、浙江楠、竹葉楠和紫楠）作為外類群。使用BEAST v2.5軟件（Bouckaert et al.， 2019）對物種分化時間進行估計。使用BEAUti軟件創(chuàng)建BEAST的輸入文件。使用不相關(guān)對數(shù)正態(tài)分布的松散分子鐘（uncorrelated lognormal relaxed clock）模型，核苷酸的替代模型選擇GTR，選用Yule模型。到目前為止，潤楠屬中尚未發(fā)現(xiàn)可信的化石。因此，根據(jù)樟科系統(tǒng)進化樹定年結(jié)果，將潤楠屬和楠屬的分化時間設(shè)置為23 Ma，使用正態(tài)分布，其他參數(shù)采用默認設(shè)置。運行1×107次馬爾科夫鏈，每隔1 000次進行1次取樣，并將最初的1×106次作為老化值舍棄。使用Tracer v.1.7軟件 （Rambaut et al.， 2018）對運行結(jié)果進行分析，并判斷各參數(shù)計算結(jié)果的收斂性。對獲得的后綴為.tree的文件使用TreeAnnotator v.2.4.7軟件進行注釋，使用Figtree軟件對獲得注釋的系統(tǒng)樹文件進行顯示。

1.5 微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析

1.5.1 異常位點、連鎖不平衡檢驗和啞等位基因檢測 使用Lositan軟件 （Antao et al.， 2008）進行中性檢驗。使用FSTAT v2.9.3.2軟件 （http：//www.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm）對篩選出的10個位點進行連鎖不平衡的顯著性檢驗。

由于本研究所使用的微衛(wèi)星引物是針對紅楠開發(fā)，采用這些引物對同屬其他物種進行研究時，可能存在啞等位基因的情況。因此， 在進行數(shù)據(jù)分析之前我們使用Microchecker軟件 （Van Oosterhout et al.， 2004）對每個種群的啞等位基因進行檢測。

1.5.2 種群遺傳多樣性分析 計算平均等位基因數(shù)（mean number of alleles， A）和等位基因豐富度（allele richness， AR）來衡量種群遺傳多樣性。使用TFPGA v1.3軟件（http：//www.marksgenetic-software.net/）計算期望雜合度（unbiased heterozyousity， HE）和觀察雜合度（observed heterozyousity， HO）。在FSTAT v2.9.3.2軟件中經(jīng)過1 000次模擬來檢驗總的近交系數(shù)（inbreeding coefficient， FIS）是否顯著偏離0。

1.5.3 遺傳聚類分析 采用STRUCTURE v2.3 （Pritchard et al.， 2000）對12個物種進行聚類分析，推斷種群遺傳結(jié)構(gòu)及每個個體在種群中分布的概率。在軟件中設(shè)置K=1到K=15，基于以上設(shè)置的K值對微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分別進行迭代周期（length of period）為1×105、MCMC為1×106次的運算，計算時選擇混合模型（admixture model）。使用Evanno等（2005）的方法得出最優(yōu)物種數(shù)K，使用最優(yōu)K值對分析的12個物種進行分類。本文使用基于DA遺傳距離的鄰接樹（NJ）法獲得每個物種間遺傳距離之間的關(guān)系。相關(guān)分析使用Population 1.2.30軟件 （https：//bioinformatics.org/populations/）計算。每個節(jié)點使用基于1 000次重復(fù)的自展概率值進行估算。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組序列分析

2.1.1 葉綠體基因組基本信息 使用72對引物對潤楠屬12個物種的長單拷貝區(qū)域進行擴增測序，最終獲得長44 025 bp的序列。12個物種共44 025 bp長度的序列上只有48個變異位點（占總序列長度的0.11%），其中單變異位點為26個（占總序列長度的0.06%）、簡約信息位點為22個（占0.05%）。在72個葉綠體DNA序列片段中，只有13個片段具多態(tài)性。因此，后續(xù)使用這13個葉綠體DNA序列片段組成長度為10 756 bp的序列矩陣進行系統(tǒng)進化分析。對12個潤楠屬物種13個序列的異質(zhì)性檢驗表明，序列間替換型式異質(zhì)性在多數(shù)物種對間不顯著，不會影響系統(tǒng)進化分析。對已測序的紅楠、刨花潤楠、銹毛潤楠和滇潤楠的葉綠體基因組比較發(fā)現(xiàn)，葉綠體基因組之間序列的相似度為99.9%，遠高于其他屬內(nèi)物種間葉綠體基因組的相似度。

2.1.2 潤楠屬系統(tǒng)進化關(guān)系 由于物種間很小的序列差異，因此基于多態(tài)葉綠體DNA片段采用不同的構(gòu)建進化樹方法未得到具一致拓撲結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)進化樹（圖2）。UPGMA樹顯示紅楠、建潤楠和狹葉潤楠聚為一支（支持率為0.99），其他的潤楠屬物種聚為一支（支持率為0.97），除這兩大支以外，其他支系的自展支持率都很低。ML樹表明建潤楠、紅楠和狹葉潤楠聚為一支，剩下的物種聚為一支，但自展支持率都很低。NJ樹表明狹葉潤楠、建潤楠和紅楠單獨成為一支（支持率為1.00），其他的9個物種聚為一支且無明顯的進化關(guān)系，支持率很低。這兩種基于距離矩陣方法給出的結(jié)果基本一致，紅楠、建潤楠和狹葉潤楠聚為一支的支持率都很高，其他物種沒有明顯進化關(guān)系（圖2）。MP樹顯示建潤楠、紅楠和狹葉潤楠聚為一支，剩下的其他物種聚為一支。

2.2 微衛(wèi)星位點分析

2.2.1 中性位點及啞等位基因分析 使用10個微衛(wèi)星位點對234個個體進行PCR擴增，均獲得清晰的產(chǎn)物。對異常位點的檢測發(fā)現(xiàn)，有4個位點分布于中性區(qū)間（95%置信區(qū)間）之外。這些位點的遺傳分化系數(shù)FST大于中性標(biāo)記模擬的FST值的0.975分位數(shù)，表明這些位點可能受到歧化選擇的作用。

10個位點兩兩之間均不存在顯著的連鎖關(guān)系，表明它們?yōu)楠毩⑦z傳的。對啞等位基因的檢測表明，10個微衛(wèi)星位點中有3個可能存在啞等位基因，對這3個可能存在啞等位基因的位點的等位基因頻率校正后用于后續(xù)遺傳多樣性的計算。

2.2.2 遺傳多樣性 10個微衛(wèi)星位點在12個物種中共檢測到179個等位基因，平均每位點等位基因數(shù)為7.8，建潤楠種群最少（平均為5.0），紅楠種群最多（10.4）。物種的獨有等位基因數(shù)都很少，其中紅楠種群的獨有等位基因最多（平均為每位點0.7個），基脈潤楠和建潤楠中沒有獨有等位基因。

12個物種中觀察雜合度和期望雜合度中等，期望雜合度為0.501（粗壯潤楠）～0.838 （瓊桂潤楠），觀察雜合度為0.442 （粗壯潤楠）～0.718 （紅楠） （表1）。近交系數(shù)都為正值，最大的為0.277 （刨花潤楠），最小的為0.103（薄葉潤楠），表明這些物種存在較高的近交（表1）。

所有物種總的遺傳分化系數(shù)FST為0.156。兩兩間的遺傳分化系數(shù)范圍為0.006～0.304，其中華潤楠和瓊桂潤楠間最小，粗壯潤楠和短序潤楠間最大。

2.3 不同分子標(biāo)記的物種進化關(guān)系及其比較

通過葉綠體基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，在這14個潤楠屬物種組成的突變網(wǎng)絡(luò)圖中，共有5個推斷的共同祖先節(jié)點，在圖中分別為V1、V2、V3、V4和V5 （圖3：A）。銹毛潤楠和短序潤楠具有共同祖先V1，黃絨潤楠和基脈潤楠具有共同祖先V2，滇潤楠、黔桂潤楠、薄葉潤楠、粗壯潤楠和瓊桂潤楠具有共同祖先V3，刨花潤楠和華潤楠具有共同祖先V4，建潤楠、紅楠和狹葉潤楠具有共同祖先V5。從V1到V2經(jīng)過2步突變，從V2到V3以及從V3到V4都只經(jīng)歷了1步突變，而從V2到V5經(jīng)歷了14步突變。

貝葉斯系統(tǒng)樹顯示短序潤楠單獨成為一支，紅楠、建潤楠和狹葉潤楠聚為一支，黃絨潤楠和基脈潤楠聚為一支，華潤楠和刨花潤楠聚為一支，剩下的5個物種聚為一支，但這些系統(tǒng)樹節(jié)點的后驗概率值都不高?；谡量葡到y(tǒng)進化樹確定的潤楠屬和楠屬分化時間為2 300萬年前（23 Ma），潤楠屬的樹冠時間（crown age）為10.75 Ma（圖3：B）。根據(jù)這2個估計時間對潤楠屬系統(tǒng)樹定年，結(jié)果表明V1形成時間大約為7.69 Ma，V2形成的時間大約為4.65 Ma， V3形成的時間大約為3.99 Ma， V4形成的時間大約為1.61 Ma，V5的形成時間大約為2.58 Ma。

使用10個中性微衛(wèi)星位點對12個潤楠屬物種的個體進行聚類， 最佳K值為2、5和8 （ΔK值最大時的K值）。在這3種情景下，聚類結(jié)果與基于葉綠體序列得到的系統(tǒng)進化關(guān)系都存在明顯的不一致，即核-質(zhì)沖突。當(dāng)K值等于2時，華潤楠、瓊桂潤楠、短序潤楠、狹葉潤楠和紅楠聚為一支，基脈潤楠、黃絨潤楠、粗壯潤楠和薄葉潤楠聚為一支，而黔桂潤楠和刨花潤楠表現(xiàn)出兩支的混雜；當(dāng)K=5時，華潤楠、瓊桂潤楠、短序潤楠和刨花潤楠聚為一支，基脈潤楠、黃絨潤楠、粗壯潤楠和薄葉潤楠聚為一支，而狹葉潤楠、建潤楠和紅楠各成為一支；當(dāng)K=8時，狹葉潤楠、建潤楠和紅楠能夠很好地各成一支，而其他幾個物種混雜比較嚴(yán)重（圖3：C）。

基于遺傳距離的最近鄰接法構(gòu)建的無根樹顯示，華潤楠、瓊桂潤楠和狹葉潤楠聚成一個支系，基脈潤楠、黃絨潤楠、粗壯潤楠和薄葉潤楠聚為一個支系，而其他的物種介于這兩個支系之間（圖3：D）。最近鄰體法計算出的各個物種之間的關(guān)系與Structure聚類的結(jié)果比較相近，華潤楠、瓊桂潤楠和狹葉潤楠親緣關(guān)系比較近，基脈潤楠、黃絨潤楠、粗壯潤楠和薄葉潤楠親緣關(guān)系比較近。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)潤楠屬下5組12個物種的葉綠體基因序列突變率較低，據(jù)此得到的系統(tǒng)進化關(guān)系不明晰，與前人的研究結(jié)果類似（Rohwer et al.， 2009; Li et al.， 2011; Liu et al.， 2022）。采用突變率較高的10個潤楠屬內(nèi)通用的核微衛(wèi)星位點，可以清晰地將12個潤楠屬物種分為5組，并且建潤楠、狹葉潤楠和紅楠可單獨分出來，其他物種分為2組?；诤宋⑿l(wèi)星數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)12個潤楠屬物種共享等位基因占比高，不同物種獨有等位基因占比很低。此外，根據(jù)核微衛(wèi)星聚類結(jié)果與基于cpDNA序列的系統(tǒng)進化關(guān)系存在明顯的不一致。這些信息表明在本研究中同域分布的潤楠屬物種間存在較強的雜交漸滲。

潤楠屬葉綠體基因組多態(tài)性極低。本研究分析的潤楠屬葉綠體基因組長單拷貝區(qū)約4.4萬個bp，但這12個物種包含的變異位點僅48個，僅占整個葉綠體基因組序列的0.1%左右，與前人的研究結(jié)果基本一致（Song et al.， 2017; Liu et al.， 2021， 2022）。在其他被子植物中，也有學(xué)者提出以往研究可能高估了葉綠體基因組的多態(tài)性（Smith， 2015）。Liu等 （2022）通過對樟科25個屬131個物種的191個葉綠體基因組序列進行分析，指出盡管葉綠體基因組序列可提高樟科系統(tǒng)進化關(guān)系的分辨率，并可為一些物種分子鑒定提供信息，但增加葉綠體基因組序列只部分提高了物種鑒別能力，仍需要大規(guī)模的核基因數(shù)據(jù)用于確定種間進化關(guān)系。

使用不同系統(tǒng)進化樹構(gòu)建方法，并基于葉綠體基因得到的潤楠屬種間關(guān)系存在一定差異。上述方法都能將建潤楠、狹葉潤楠和紅楠這3個物種與其他物種分開。從單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，這3個物種之間的差異相對于它們的共同祖先而言有2步（建潤楠）、4步（狹葉潤楠）和5步（紅楠）突變。但是，其他9個物種間的關(guān)系非常混亂，不同數(shù)據(jù)及不同方法得到的結(jié)果差異很大。這些不一致的結(jié)果主要是因葉綠體分辨率較低而造成的。樟科植物葉綠體片段的分辨率都較低（Liu et al.， 2022），即使采用更多的葉綠體基因組片段和物種，最終也難以得到支持率較高的系統(tǒng)進化關(guān)系（Liu et al.， 2021）。因此，僅根據(jù)葉綠體基因組序列很難構(gòu)建可信的潤楠屬種間系統(tǒng)進化樹。

采用突變率較高的核微衛(wèi)星位點，可以提升潤楠屬物種分辨率。首先，基于核微衛(wèi)星分析的結(jié)果表明建潤楠、短序潤楠和紅楠可單獨分出來，這與基于葉綠體序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹得到的結(jié)果基本一致，表明這3個物種之間的進化關(guān)系在葉綠體與核基因中都有較高的支持率。然后，與葉綠體序列得到的結(jié)果相比，核微衛(wèi)星可進一步將華潤楠、瓊桂潤楠、狹葉潤楠和刨花潤楠分為1組，將黔桂潤楠、基脈潤楠、黃絨潤楠、粗壯潤楠和薄葉潤楠分為另外1組。最后，當(dāng)進一步劃分時，上述2組物種內(nèi)則出現(xiàn)明顯的個體混合現(xiàn)象，提示這些物種間可能存在較強的雜交漸滲。

核微衛(wèi)星數(shù)據(jù)顯示不同物種間共享大量等位基因且獨有等位基因很少，同時也存在明顯的核-質(zhì)沖突。上述結(jié)果可能是因物種間頻繁的漸滲雜交而導(dǎo)致，也可能是共同祖先等位基因保留（Duan et al.， 2023; Feng et al.， 2023）。由于核微衛(wèi)星突變速率較快（10-6～10-3每位點每代）且為中性標(biāo)記，大部分位點不受選擇影響（Vieira et al.， 2016），因此共同祖先保留的微衛(wèi)星位點在不同物種中各自發(fā)生突變的可能性較高。在隨機漂變且缺少種間漸滲的情況下，不同物種共享相同微衛(wèi)星等位基因的可能性較低。因此，潤楠屬物種共享大量的等位基因不太可能因共同祖先等位基因的保留而引起。這表明潤楠屬物種間廣泛的漸滲雜交是不同物種共享大量等位基因且獨有等位基因少的合理解釋。

由于種間漸滲雜交的廣泛存在，需要綜合利用形態(tài)特征、分子標(biāo)記對潤楠屬進行分類修訂。漸滲雜交現(xiàn)象在很多植物中普遍存在（Suarez-Gonzalez et al.， 2018），尤其是在多樣性較高的屬內(nèi)。例如，F(xiàn)ogelqvist等（2015）使用STRUCTURE軟件采用384個SNPs和4個葉綠體SSR位點研究3種同域分布的柳屬（Salix）植物，發(fā)現(xiàn)一個柳屬雜交區(qū)具有較多的雜交漸滲個體；基于核SSR數(shù)據(jù)，López-Caamal等 （2018）分析了Tithonia tubaeformis和圓葉腫柄菊（T. rotundifolia）的雜交漸滲現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)很多雜交漸滲個體具有不同親本的次生代謝產(chǎn)物。多數(shù)潤楠屬物種都分布于我國華南和西南地區(qū)，本研究特意選取12個地理分布重疊的潤楠屬物種進行研究。此外，潤楠屬物種多為蟲媒傳粉（Watanabe et al.， 2015; Tong et al.， 2023），重疊的地理分布為潤楠屬物種共享傳粉昆蟲提供了條件。因此，潤楠屬內(nèi)同域分布物種間廣泛的漸滲雜交對分類和系統(tǒng)進化關(guān)系界定產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。種間漸滲雜交通過基因流動導(dǎo)致不同物種基因庫的混合，從而模糊物種間的界線，導(dǎo)致形態(tài)特征重疊、相似。種間漸滲雜交形成復(fù)雜的系統(tǒng)進化關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，而非簡單的樹狀結(jié)構(gòu)（Stull et al.， 2023），這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)反映了不同物種間多次基因交換事件。多次漸滲雜交事件使得傳統(tǒng)的系統(tǒng)進化樹不再適用，需要使用網(wǎng)絡(luò)分析方法來更準(zhǔn)確地描述這些物種之間的演化關(guān)系。復(fù)雜系統(tǒng)進化關(guān)系的界定不僅有助于識別出新的雜交物種，而且還可揭示出傳統(tǒng)方法無法檢測的基因流路徑。此外，廣泛的漸滲雜交對潤楠屬的分類也提出了更高的要求，需要結(jié)合多種數(shù)據(jù)源，包括形態(tài)學(xué)特征、分子標(biāo)記、生態(tài)位信息等，更需要開發(fā)新的分析工具，綜合分析以得到更為可信的分類結(jié)果和種間漸滲雜交關(guān)系。

綜上所述，增加葉綠體基因組序列并不能提高同域分布的潤楠屬種間系統(tǒng)進化關(guān)系的分辨率，微衛(wèi)星數(shù)據(jù)可以獲得分辨率更高的種間關(guān)系，但物種間的漸滲雜交對利用核基因數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)進化關(guān)系分析的影響較大；不同潤楠屬物種間存在大量的共享等位基因及很少的獨有等位基因，表明潤楠屬物種間發(fā)生了廣泛的漸滲雜交，模糊了種間的界限。后續(xù)仍需使用具更高分辨率的核基因組序列，并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法，開發(fā)新的有效的分析工具，以理解潤楠屬內(nèi)復(fù)雜的系統(tǒng)進化關(guān)系，為該類群的保護和可持續(xù)利用提供基礎(chǔ)。

致謝 感謝上海辰山植物園的胡永紅教授級高工、黃衛(wèi)昌教授級高工和上海植物園肖月娥教授級高工在論文準(zhǔn)備和修改中提供的幫助；感謝廣西植物研究所胡興華研究員對本研究提出的寶貴建議；感謝上海植物園于鳳揚在分子實驗中給予的幫助。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）

基金項目：" 上海市綠化和市容管理局項目（G232408，F(xiàn)132415）。

第一作者： 蔣凱 （1987—），博士，工程師，主要從事植物保育遺傳學(xué)研究，（E-mail）jiangkai@csnbgsh.cn。

*通信作者：" 陳小勇，博士，教授，研究方向為動植物互作及進化，（E-mail）xychen@des.ecnu.edu.cn。