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    保護(hù)液對重組蛋白穩(wěn)定性影響及其化學(xué)發(fā)光應(yīng)用研究

    2025-03-27 00:00:00沈超
    現(xiàn)代鹽化工 2025年1期
    關(guān)鍵詞:化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定性

    摘要:探討了不同保護(hù)液配方對重組蛋白穩(wěn)定性的影響,并將其應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)。通過正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳保護(hù)液配方,包括甘油、蔗糖、BSA和吐溫20等成分。結(jié)果表明,優(yōu)化后的保護(hù)液能顯著提高重組熒光素酶的熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性。將該保護(hù)液應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測人血清中甲胎蛋白(AFP),檢測靈敏度提高了2倍,線性范圍擴(kuò)大到0.1~1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩(wěn)定性和改善化學(xué)發(fā)光檢測性能提供了新的思路。

    關(guān)鍵詞:重組蛋白;保護(hù)液;穩(wěn)定性;化學(xué)發(fā)光;免疫分析

    重組蛋白在生物醫(yī)藥、診斷試劑等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用,但其穩(wěn)定性一直是制約應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。提高重組蛋白的穩(wěn)定性對于延長其保質(zhì)期、保持活性至關(guān)重要。保護(hù)液作為一種常用的穩(wěn)定劑,其配方設(shè)計直接影響蛋白的穩(wěn)定性。本研究以重組熒光素酶為模型蛋白,系統(tǒng)研究了保護(hù)液成分對其穩(wěn)定性的影響,并將優(yōu)化后的保護(hù)液應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析,以期為相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

    1材料與方法

    1.1材料與試劑

    本研究所用的主要材料和試劑包括:重組熒光素酶(由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得)、甘油、蔗糖、牛血清白蛋白、吐溫20、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、D熒光素(化學(xué)發(fā)光底物)、人甲胎蛋白(AFP)標(biāo)準(zhǔn)品、抗AFP單克隆抗體和多克隆抗體、羧基修飾磁性納米顆粒(直徑1 μm)、1乙基3(3二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺。磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)和三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 8.0,由實(shí)驗(yàn)室自制)。所有化學(xué)試劑均為分析純或更高純度,實(shí)驗(yàn)用水為超純水系統(tǒng)制備的去離子水。

    1.2儀器與設(shè)備

    研究使用的主要儀器設(shè)備包括:高速離心機(jī)、紫外可見分光光度計、蛋白電泳系統(tǒng)、蛋白純化系統(tǒng)、多功能酶標(biāo)儀、恒溫混勻儀、pH計、電子天平、微量離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、振蕩器、冷凍離心機(jī)、超速離心機(jī)、倒置熒光顯微鏡和納米粒度分析儀。這些儀器設(shè)備覆蓋了蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、分析和應(yīng)用的全過程,確保了實(shí)驗(yàn)操作的精確性和數(shù)據(jù)的可靠性。所有儀器在使用前均按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

    1.3重組熒光素酶的表達(dá)與純化

    重組熒光素酶的表達(dá)采用大腸桿菌BL21(DE3)株系,將含有目的基因的pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入菌株中[1],挑選單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過夜。次日將培養(yǎng)物按1∶100比例接種至1 L LB培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)至OD 600達(dá)0.6~0.8。加入IPTG至終濃度0.5 mmol誘導(dǎo)表達(dá),18 ℃培養(yǎng)16 h。離心收集菌體,超聲破碎后12 000 g離心20 min分離上清液。上清液經(jīng)過NiNTA親和層析柱純化,用含20 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗滌,隨后用含250 mmol咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。收集的蛋白溶液用10 kDa截留分子量的超濾管濃縮并更換緩沖液為PBS(pH 7.4)。純化后的蛋白經(jīng)SDSPAGE和Western blot鑒定,使用BCA法測定蛋白濃度。最后,將純化的重組熒光素酶分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4保護(hù)液配方優(yōu)化

    采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計法優(yōu)化保護(hù)液配方。選取4個主要因素:甘油、蔗糖、BSA和吐溫20,每個因素設(shè)置3個水平。設(shè)計L9(3^4)正交表,共進(jìn)行9組實(shí)驗(yàn)。以PBS(pH 7.4)為基礎(chǔ)緩沖液,按照正交表配制不同組合的保護(hù)液。將純化的重組熒光素酶稀釋至0.1 mg/mL,與等體積的各組保護(hù)液混合。將混合液分裝后在37 ℃、4 ℃和-20 ℃條件下儲存,分別在0、1、7、14、30天測定酶活性。酶活性測定采用化學(xué)發(fā)光法,使用D熒光素作為底物,在多功能酶標(biāo)儀上測量發(fā)光值。以酶活性保留率作為評價指標(biāo),通過方差分析確定各因素對酶活性的影響程度。根據(jù)分析結(jié)果,選擇最優(yōu)配方進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),并與商業(yè)保護(hù)液進(jìn)行對比。最終確定的最佳保護(hù)液配方為:15%(v/v)甘油、10%(w/v)蔗糖、0.1%(w/v)BSA和0.05%(v/v)吐溫20。

    1.5重組熒光素酶穩(wěn)定性評價

    重組熒光素酶的穩(wěn)定性評價,主要從熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性2個方面進(jìn)行評估。熱穩(wěn)定性測試中,將酶液(0.1 mg/mL)分別在25 ℃、37 ℃和45 ℃恒溫水浴中孵育,每隔30 min取樣測定剩余酶活性,直至4 h。長期儲存穩(wěn)定性測試中,將酶液在4 ℃和-20 ℃條件下儲存,分別在0、7、14、30、60、90天取樣測定剩余酶活性。酶活性測定采用化學(xué)發(fā)光法,使用100 μmol D熒光素作為底物,在多功能酶標(biāo)儀上測量30 s內(nèi)的累積發(fā)光值[2],以初始酶活性為100%,計算各時間點(diǎn)的酶活性保留率。通過繪制酶活性保留率隨時間變化的曲線,評估重組熒光素酶在不同條件下的穩(wěn)定性。

    1.6化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

    采用雙抗體夾心法建立化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。將抗AFP單克隆抗體偶聯(lián)到羧基修飾磁性納米顆粒上,取50 μL磁珠懸液,用MES緩沖液(pH 6.0)洗滌3次,加入10 μg抗體、50 μL EDC(10 mg/mL)和50 μL NHS(10 mg/mL),室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)后用PBS洗滌3次,用1% BSA封閉1 h。將偶聯(lián)好的磁珠與100 μL樣品(或標(biāo)準(zhǔn)品)混合,37 ℃孵育1 h。洗滌后加入100 μL生物素化抗AFP多克隆抗體(1 μg/mL),37 ℃孵育30 min。再次洗滌后加入100 μL重組熒光素酶親和素復(fù)合物(1∶2 000稀釋),室溫孵育15 min。最后洗滌,加入100 μL D熒光素(10 μmol),立即在多功能酶標(biāo)儀上測量化學(xué)發(fā)光值。

    2結(jié)果與討論

    2.1保護(hù)液配方對重組熒光素酶熱穩(wěn)定性的影響

    本研究考察了不同保護(hù)液配方對重組熒光素酶熱穩(wěn)定性的影響。在37 ℃條件下,添加15%甘油和10%蔗糖的保護(hù)液顯著提高了酶的熱穩(wěn)定性,4 h后仍保留80%以上的活性,而無保護(hù)液的對照組僅保留30%活性[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),0.1%牛血清白蛋白的加入可進(jìn)一步提高熱穩(wěn)定性,使4 h后的活性保留率達(dá)到90%。這可能是由于甘油和蔗糖形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu),而牛血清白蛋白則通過表面吸附減少了蛋白質(zhì)分子間的相互作用,從而抑制了熱變性的發(fā)生。

    2.2保護(hù)液配方對重組熒光素酶長期儲存穩(wěn)定性的影響長期儲存穩(wěn)定性研究結(jié)果表明,優(yōu)化后的保護(hù)液配方顯著延長了重組熒光素酶的儲存期限。在4 ℃條件下,添加保護(hù)液的酶液在90天后仍保持85%的初始活性,而無保護(hù)液的對照組活性降至40%。-20 ℃儲存條件下,保護(hù)液的效果更為顯著,90天后酶活性保留率高達(dá)95%。分析發(fā)現(xiàn),0.05%吐溫-20的加入對長期儲存穩(wěn)定性有顯著貢獻(xiàn),這可能是由于其減少酶分子在反復(fù)凍融過程中的聚集。此外,蔗糖可能通過形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu),進(jìn)一步保護(hù)酶分子免受凍融損傷[4]。

    2.3最佳保護(hù)液配方的確定

    通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計和單因素優(yōu)化,最終確定了重組熒光素酶的最佳保護(hù)液配方:15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20,以磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)為基礎(chǔ)。該配方在熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的效果。進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,該保護(hù)液配方能夠使重組熒光素酶在37 ℃條件下4 h后保留90%以上的活性,在4 ℃儲存90天后保留85%以上的活性。與商業(yè)保護(hù)液相比,本研究優(yōu)化的配方在各項(xiàng)指標(biāo)上均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢,為重組熒光素酶的穩(wěn)定性保護(hù)提供了有效方案。

    2.4優(yōu)化保護(hù)液在化學(xué)發(fā)光免疫分析中的應(yīng)用

    將優(yōu)化后的保護(hù)液應(yīng)用于人甲胎蛋白(AFP)化學(xué)發(fā)光免疫分析中,顯著提高了檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。與未添加保護(hù)液的對照組相比,檢測靈敏度提高了2倍,最低檢測限達(dá)到0.1 ng/mL[5]。線性范圍擴(kuò)大到0.1~1 000.0 ng/mL,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)小于5%,批間變異系數(shù)小于8%。加入保護(hù)液后,檢測試劑在4 ℃條件下可穩(wěn)定保存3個月,室溫下工作8 h活性無明顯下降。這些結(jié)果表明,優(yōu)化的保護(hù)液配方顯著改善了化學(xué)發(fā)光免疫分析的性能,為臨床診斷提供了更可靠的方法。

    3結(jié)語

    通過系統(tǒng)優(yōu)化保護(hù)液配方,成功提高重組熒光素酶的穩(wěn)定性,并將其應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析中。研究結(jié)果表明,優(yōu)化后的保護(hù)液配方(15%甘油、10%蔗糖、0.1%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20)顯著提高重組熒光素酶的熱穩(wěn)定性和長期儲存穩(wěn)定性。在37 ℃條件下4 h后仍保留90%以上的活性,在4 ℃儲存90天后保留85%以上的活性。將優(yōu)化后的保護(hù)液應(yīng)用于人甲胎蛋白(AFP)化學(xué)發(fā)光免疫分析中,檢測靈敏度提高了2倍,最低檢測限達(dá)到0.1 ng/mL,線性范圍擴(kuò)大到0.1~1 000.0 ng/mL。為提高重組蛋白穩(wěn)定性和改善化學(xué)發(fā)光免疫分析性能提供了新的思路和方法,具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

    參考文獻(xiàn):

    [1]孔祥君,陳玉妹,林英武,等.金屬卟啉重組蛋白的光活性與光穩(wěn)定性研究[J].南華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2023,37(3):65-70,98.

    [2]呂玲,邢義高,張秀濤,等.通用型細(xì)胞凍存保護(hù)液的探索[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2022,17(4):347-349.

    [3]周鷹,吳美麗,朱晗婷,等.過敏原Der p 23重組蛋白制備及其特異性IgE化學(xué)發(fā)光檢測方法的建立[J].中國免疫學(xué)雜志,2020,36(20):2491-2494.

    [4]杭鑫茹,耿榮慶,錢林.牛奶過敏原β乳球蛋白的重組制備及磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測法的建立[J].生物技術(shù)通報,2020,36(3):193-198.

    [5]王兢磊,孔飛志,黨智笙,等.t-PAIC單克隆抗體制備及磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測[J].包裝學(xué)報,2023,15(4):59-67.

    作者簡介:沈超,女,黑龍江哈爾濱人,研發(fā)工程師,碩士,研究方向:基因克隆重組蛋白的表達(dá)純化、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及免疫診斷試劑。

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