海藻酸鹽/絲素基復(fù)合水凝膠的制備及性能研究

摘要：以海藻酸鈉和絲素蛋白為原料，通過化學(xué)交聯(lián)技術(shù)制備了不同比例的海藻酸鹽聚乙烯醇/絲素蛋白羧甲基殼聚糖復(fù)合水凝膠。研究重點(diǎn)在于觀察凝膠化前后材料結(jié)構(gòu)的變化，以及不同絲素蛋白比例對復(fù)合水凝膠溶脹性能和透氣性能的影響。實驗結(jié)果表明，復(fù)合水凝膠具有良好的機(jī)械性能和較高的溶脹度，最高可達(dá)5 658.3%。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SF/CMCS比例為6/4，且SA/PVA厚度為1 mm時，復(fù)合水凝膠具有最高的透氣率和溶脹率。為水凝膠材料的設(shè)計和應(yīng)用提供了有價值的指導(dǎo)，并為未來的生物醫(yī)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：海藻酸鹽；絲素基復(fù)合水凝膠；化學(xué)交聯(lián)

水凝膠作為一種具有高吸水性和良好生物相容性的生物材料，在組織工程、藥物釋放和傷口愈合等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景［1］。為了進(jìn)一步提高水凝膠的性能，本研究以海藻酸鈉和絲素蛋白為主要原料，采用化學(xué)交聯(lián)技術(shù)制備了不同比例的海藻酸鹽聚乙烯醇/絲素蛋白羧甲基殼聚糖的復(fù)合水凝膠。通過對凝膠化前后材料結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行觀察，以及不同絲素蛋白比例對復(fù)合水凝膠溶脹性能和透氣性能的影響進(jìn)行研究，為水凝膠材料的設(shè)計和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1研究方法

1.1海藻酸鹽/絲素基復(fù)合水凝膠的制備設(shè)備

1.1.1實驗儀器

實驗儀器包括：水浴鍋、高速離心機(jī)、電子計量秤、紫外可見分光光度計、磁力攪拌器和鼓風(fēng)干燥箱等。

1.1.2實驗試劑

實驗試劑包括：蠶繭（絲素）、透析袋、無水碳酸鈉、無水氯化鈣、無水乙醇、羧甲基殼聚糖粉末、海藻酸鹽、碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、聚乙烯醇（PVA）和乳酸鈣等。

1.2海藻酸鹽/絲素基復(fù)合水凝膠的制備方法

1.2.1絲素蛋白提取

1.2.1.1蠶繭脫膠

將1 L去離子水加熱至沸騰，加入5 g無水碳酸鈉粉末，待其完全溶解后，將預(yù)先用精密天平稱取的50 g蠶繭殼用剪刀剪成塊狀，撕去內(nèi)壁，放入0.5% Na2CO3溶液中，邊煮邊攪拌30 min。隨后取出絲并用去離子水清洗2～3次，重復(fù)脫膠3次。置于60 ℃的烘箱中烘干得到純絲素纖維。

1.2.1.2SF的制備

取11.1 g CaCl2、9.214 g CH3CH2OH和14.4 g去離子水混合均勻配制成三元溶液。將物質(zhì)的量比為1∶2∶8的三元溶劑（CaCl2、CH3CH2OH、H2O）在（70±5 ℃）的水浴下溶解絲素（質(zhì)量比為1∶10）：將烘干的10 g絲素纖維放入100 g物質(zhì)的量比為1∶2∶8的三元溶劑中，在65 ℃的水浴下溶解2 h，直至絲素纖維完全溶解（攪拌時無纖維撕扯感）。將溶解的絲素裝入透析袋中密封，用去離子水透析2天，每4 h換一次水，以除去小分子物質(zhì)。用硝酸銀和碳酸鈉檢驗鈣氯離子，再用高速離心機(jī)在9 000 r/min下離心20 min，得到淺黃色透明的再生SF溶液。采用聚乙二醇進(jìn)行濃縮后，利用比重法測量質(zhì)量分?jǐn)?shù)，稱取含4 g的絲素蛋白溶液定容于100 mL容量瓶配制質(zhì)量濃度為4%的SF溶液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3SF蛋白電泳檢測

（1） 凝膠裝板

將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，用蒸餾水沖洗干凈，放在干燥箱（50 ℃）干燥后取出。使玻璃板形成一個“夾心”凝膠腔，用封口膜將下方、左右兩側(cè)封住從而避免出現(xiàn)漏膠。把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽，將電泳槽、凝膠模子組成的垂直板型電泳裝置垂直放置在水平臺面上，灌注膠液。

（2） 凝膠制備

按配方將各工作液混合，將分離膠緩慢注入膠液槽中，上面留出2 cm為以后灌濃縮膠用。在上面均勻緩慢注入蒸餾水，使分離膠表面平直，排除氣泡隔絕空氣隨后放在干燥箱（50 ℃，30 min）待膠凝固后棄水，并用濾紙吸干水分，避免觸碰分離膠。緩慢注入濃縮膠，將梳子插入濃縮膠中，放在干燥箱（50 ℃，30 min）待聚合，緩慢拔出樣梳。

（3） 含DTT蛋白上樣緩沖液和不含DTT上樣緩沖液的制備

取60 μL蛋白樣品，分別加入20 μL 5×含DTT上樣緩沖液和不含DTT的上樣緩沖液。

1 mol/L DTT溶液配制方法：用20 mL 0.01 mol/L乙酸鈉溶液（pH 5.2）溶解3.09 g DTT；1.0 mol/L TrisHCl（pH 6.8） 2 mL，1.0 mol/L DTT 4 mL，SDS 0.8 g，溴芬藍(lán)0.04 g，甘油4 mL，加蒸餾水定容至20 mL。

4×蛋白上樣緩沖液的配制：2.0 mL 1 mol/L TrisHCl（pH 6.8），0.8 g SDS，4.0 mL甘油，1.0 mL 0.5 mol/L EDTA，8 mg溴酚藍(lán)；0.5 mol/L EDTA配制：稱取1.861 g Na2EDTA2H2O，加入約8 mL的去離子水，充分?jǐn)嚢韬笥?0 g NaOH顆粒加去離子水定容至10 mL，pH約至8.0。第一個樣孔加入5 μL蛋白marker，后面各孔加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液進(jìn)行上樣，依次為樣品1含DTT、樣品1不含DTT、樣品2含DTT、樣品2不含DTT。

（4） 電泳

第一個樣孔加入5 μL蛋白marker，后面各孔加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液進(jìn)行上樣，依次為樣品1含DTT、樣品1不含DTT、樣品2含DTT、樣品2不含DTT。加入1×電泳緩沖液（pH 8.3的Tris甘氨酸緩沖液和蒸餾水以4∶1混合），加入上下槽電極液（1×電泳緩沖液），上槽接負(fù)極，下槽接正極，起始電壓為80 V、電流為44 mA，樣品進(jìn)入分離膠后，電壓為150 V、電流在84 mA到94 mA上下浮動。待前沿指示劑到達(dá)分離膠下沿2 cm處（約2 h）停止電泳，結(jié)束后將濃縮膠部分去掉。

1.2.2PVASA內(nèi)膜水凝膠制備

1.2.2.1SAPVA水凝膠制備

各稱取12.5 g氯化鈣和乳酸鈣溶解于2 L的去離子水中，配制復(fù)合鈣溶液。稱取4 g SA溶于100 mL去離子水中，配制質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為4%的SA溶液。稱取20 g PVA放置在200 mL去離子水中，70 ℃溶脹30 min，100 ℃攪拌2 h，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PVA溶液。將PVASA以質(zhì)量比2∶1混合，攪拌1 h，靜置脫泡，得到其共混液。

1.2.2.2SA-PVA水凝膠制備

將SA-PVA溶液倒入培養(yǎng)皿中，并將內(nèi)膜厚度分別控制在1.0 mm、2.5 mm、4.0 mm。將其浸入復(fù)合鈣溶液中交聯(lián)4 h形成內(nèi)膜凝膠。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)合水凝膠的形成與結(jié)構(gòu)變化

在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，水凝膠作為一種重要的生物兼容性材料，其制備技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。EDC［1乙基3（3二甲基氨基丙基）碳二亞胺］化學(xué)交聯(lián)方法，是構(gòu)建水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的常用手段之一。以下是對該方法的深入分析：

首先，EDC化學(xué)交聯(lián)機(jī)制涉及在絲素（Fibroin）與羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl Chitosan， CMC）之間形成酰胺鍵，從而構(gòu)筑一個穩(wěn)定的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。在此過程中，絲素作為一種源于蠶絲的天然蛋白質(zhì)，不僅具有出色的生物相容性和生物降解性，而且其二級結(jié)構(gòu)的改變對水凝膠的最終性能至關(guān)重要。具體而言，絲素二級結(jié)構(gòu)的調(diào)整，如β折疊結(jié)構(gòu)的形成，能夠顯著影響水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和彈性。研究結(jié)果表明，這種復(fù)合水凝膠具有較高的彈性，說明其在承受應(yīng)力時具有良好的形變恢復(fù)能力。這種優(yōu)良的機(jī)械性能對于水凝膠在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的可行性至關(guān)重要，尤其是在組織工程、藥物遞送和生物傳感器等領(lǐng)域［2］。

2.2溶脹度與透氣性的研究

溶脹度是水凝膠的關(guān)鍵物理特性之一，它定義為水凝膠在吸水后體積增加的百分比。溶脹度對于水凝膠的應(yīng)用至關(guān)重要，因為它決定了水凝膠在生理環(huán)境中的水分保持能力，進(jìn)而影響其力學(xué)性能和生物學(xué)性能。在當(dāng)前研究中，SAPVA/SFCMCS復(fù)合水凝膠展現(xiàn)出高達(dá)5 658.3%的溶脹度，這一顯著特征表明該水凝膠具有極高的吸水能力，這一特性對于其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用具有重要價值［3］。

高值溶脹度歸因于以下因素：

（1） 交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的靈活性：水凝膠的高溶脹度源于其交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的靈活性。當(dāng)交聯(lián)點(diǎn)之間的距離足夠大時，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠在水合作用下伸展，允許更多的水分子進(jìn)入并填充網(wǎng)絡(luò)空隙。

（2） 多孔結(jié)構(gòu)：水凝膠的多孔結(jié)構(gòu)提供了大量的孔隙，這些空間在水溶脹時被水分占據(jù)，從而增加了溶脹度。

研究結(jié)果表明，在SF/CMCS的質(zhì)量比為6/4時，以及SA/PVA的厚度為1 mm的條件下，制備的復(fù)合水凝膠展現(xiàn)出最高的透氣率和溶脹率。這一結(jié)果可以解釋如下：在水凝膠制備過程中，SF/CMCS的質(zhì)量比決定了交聯(lián)密度。在6/4的比例下，交聯(lián)密度達(dá)到了一個最佳的平衡點(diǎn)，既保證了水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，又保持了足夠的孔隙度以支持高溶脹度；孔隙結(jié)構(gòu)是由水凝膠中交聯(lián)點(diǎn)的分布和密度決定的。在最佳比例下，水凝膠的孔隙結(jié)構(gòu)最有利于水分和氣體的傳輸。

3結(jié)語

成功制備了不同比例的SAPVA/SFCMCS復(fù)合水凝膠，并通過實驗觀察了凝膠化前后材料結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，復(fù)合水凝膠具有良好的機(jī)械性能和較高的溶脹度。此外，通過探討不同絲素蛋白比例對復(fù)合水凝膠溶脹性能和透氣性能的影響，發(fā)現(xiàn)SF/CMCS比例為6/4，且SA/PVA厚度為1 mm的復(fù)合水凝膠具有最高的透氣率和溶脹率。本研究為水凝膠材料的設(shè)計和應(yīng)用提供了有價值的指導(dǎo)，并為未來的生物醫(yī)學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］V·M·金泰爾，M·西蒙內(nèi)蒂，F(xiàn)·內(nèi)羅蒂，等.海藻酸鹽膨潤土生物復(fù)合水凝膠制備的水蒸氣捕獲用熱質(zhì)交換器及其制造方法：202180062389.0［P］.2024-07-17.

［2］賈新宇，戰(zhàn)藝偉，邢雅成，等.應(yīng)變響應(yīng)抗凍保水海藻酸鈣/聚乙烯醇導(dǎo)電水凝膠［J］.山東化工，2023，52（7）：12-14.

［3］宋文山，王園園，杜芬，等.魚皮膠原蛋白殼聚糖復(fù)合海藻酸鹽水凝膠敷料對燒燙傷創(chuàng)面的促愈合作用［J］.中國海洋藥物，2018，38（3）：46.

作者簡介：李奉原，男，河南輝縣人，本科在讀，研究方向：絲素蛋白、水凝膠天然再生材料。