一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的糜子高效遺傳轉(zhuǎn)化方法

摘""要：糜子（Panicum"miliaceum"L.）是我國傳統(tǒng)的糧食作物，截至目前，針對糜子遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究仍較少，本研究旨在建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的糜子高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。以糜子品種冀黍5號的成熟種子為外植體，在CIM和MSD誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分別誘導(dǎo)糜子的胚性愈傷，以其作為轉(zhuǎn)化受體材料，用含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染60"min并共培養(yǎng)6"d，轉(zhuǎn)接至含0.025"g/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選出抗性愈傷，接著在含0.015"g/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上分化，最后在含0.015"g/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上生根成苗，用載體特異性引物對再生植株進(jìn)行PCR檢測，鑒定其是否為陽性轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)多個批次的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)糜子的抗性再生植株的篩選效率和轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明：CIM和MSD誘導(dǎo)培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出糜子胚性愈傷，但CIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)的糜子胚性愈傷效果更好；糜子胚性愈傷在被農(nóng)桿菌侵染及與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，經(jīng)在含潮霉素的培養(yǎng)基上篩選、分化和生根后獲得多株抗性再生糜子植株，3次試驗(yàn)獲得的糜子抗性再生植株的PCR鑒定陽性率為100%，平均轉(zhuǎn)化效率為30%以上。本研究成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的糜子遺傳轉(zhuǎn)化方法，操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，成本低廉，且轉(zhuǎn)化不受季節(jié)限制，能規(guī)?；_展，為糜子的遺傳改良提供有效的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：糜子；農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率中圖分類號：S516""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

An"Efficient"Genetic"Transformation"Method"for"Broomcorn"Millet"Mediated"by"Agrobacterium"tumefaciens

XIA"Qiyu1，"XIANG"Yanmiao2*，"LIU"Yanan2，"LI"Haiquan2，"CHENG"Ruhong2，"GUO"Anping1，"LIU"Guoqing2**，"ZHAO"Hui1**

1."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Hainan"Key"Laboratory"for"Biosafety"Monitoring"and"Molecular"Breeding"in"Off-Season"Reproduction"Regions，"Sanya，"Hainan"572024，"China;"2."Institute"of"Millet"Crops，"Hebei"Academy"of"Agriculture"and"Forestry"Sciences，"Shijiazhuang，"Hebei"050035，"China

Abstract："Broomcorn"millet"（Panicum"miliaceum"L.）"is"a"traditional"grain"crop"in"China."Currently，"there"is"still"limited"research"on"the"genetic"transformation"methods"for"P."miliaceum."This"study"aimed"to"establish"an"efficient"genetic"transformation"method"for"P."miliaceum"mediated"by"Agrobacterium."Mature"seeds"of"the"millet"variety"Jishu"5"were"used"as"the"explants"to"induce"embryogenic"callus"of"millet"on"CIM"and"MSD"induction"media，"respectively."They"were"used"as"the"transformation"receptor"materials"and"infected"with"Agrobacterium"containing"plant"expression"vectors"for"60"minutes"and"co-cultured"for"6"days."The"calli"were"then"transferred"to"a"screening"medium"containing"0.025"g/L"of"hygromycin"to"screen"for"resistant"calli."Then，"they"differentiated"on"a"differentiation"medium"containing"0.015"g/L"of"hygromycin."Finally，"they"rooted"into"seedlings"on"a"rooting"medium"containing"0.015"g/L"of"hygromycin."PCR"detection"was"performed"on"the"regenerated"plants"using"vector"specific"primers"to"identify"whether"they"were"positive"transgenic"plants."Based"on"the"multiple"batches"of"transformation"experiments，"the"screening"efficiency"and"transformation"efficiency"of"resistant"regenerated"plants"of"broomcorn"millet"were"statistically"analyzed."The"results"showed"that"both"CIM"and"MSD"media"could"induce"embryogenic"callus"of"broomcorn"millet，"but"CIM"medium"had"a"better"effect"on"inducing"embryogenic"callus"of"broomcorn"millet."After"being"infected"by"Agrobacterium"and"co-cultured"with"Agrobacterium，"the"multiple"resistant"regenerated"plants"were"obtained"through"screening，"differentiation，"and"rooting"on"a"medium"containing"hygromycin."The"PCR"identification"positive"rate"of"the"resistant"regenerated"plants"obtained"from"three"experiments"was"100%，"and"the"average"transformation"efficiency"was"over"30%."This"study"successfully"established"an"Agrobacterium"mediated"genetic"transformation"method"for"broomcorn"millet，"which"is"simple"to"operate，"efficient，"cost-effective，"and"not"limited"by"seasons."It"could"be"carried"out"on"a"large"scale，"providing"an"effective"technical"means"for"genetic"improvement"of"broomcorn"millet.

Keywords："broomcorn"millet"（Panicum"miliaceum"L.）;"Agrobacterium;"genetic"transformation;"transformation"efficiency

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.005

糜子（Panicum"miliaceum"L.），屬禾本科黍?qū)伲鹪从谖覈狞S河流域，又名黍稷，一年生小粒禾谷類作物，是人類最早馴化的作物之一，具有生育期短、抗旱耐瘠等特點(diǎn)，在干旱環(huán)境中具生產(chǎn)優(yōu)勢，主要分布在亞洲和歐洲的半干旱地區(qū)[1-3]。在中國，糜子曾是華北地區(qū)的主糧，如今僅在山區(qū)和邊遠(yuǎn)地帶栽培，年種植面積約32萬hm2，產(chǎn)量約30萬t[4]。目前，全球糜子種質(zhì)資源有29"000余份，我國糜子種質(zhì)資源庫有9885份糜子資源[5-6]。與玉米、水稻等作物相比，糜子馴化水平低，具有許多野生性狀，這些性狀嚴(yán)重阻礙了糜子的育種進(jìn)程及品種改良，成為現(xiàn)代糜子遺傳改良的重點(diǎn)。目前我國糜子育種方法落后，主要為雜交育種和誘變育種等常規(guī)育種方法，分子標(biāo)記輔助選擇育種也很少[7-8]?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展，為糜子的育種及品種改良提供了一種快速有效的途徑。但由于糜子的遺傳轉(zhuǎn)化研究發(fā)展比較緩慢，嚴(yán)重影響了糜子的轉(zhuǎn)基因育種速度。因此，建立糜子的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，對糜子的育種及品種改良尤為重要。

目前常見的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法為基因槍法和農(nóng)桿菌法?；驑尫ㄊ菍藥康幕虻腄NA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織中，通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，可再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽性植株即為轉(zhuǎn)基因植株[9]。其主要優(yōu)點(diǎn)是不受受體植物范圍的限制，但該儀器不易獲得，且耗材成本高昂，操作復(fù)雜，外源基因插入拷貝數(shù)高，影響了基因槍法的廣泛應(yīng)用。農(nóng)桿菌法是將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株，具有操作簡單，成本低，遺傳穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率高且外源基因插入拷貝數(shù)低等優(yōu)點(diǎn)，目前在多種植物中廣泛應(yīng)用[10-16]。本研究以糜子品種冀黍5號的成熟種子為外植體，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的糜子高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，為糜子的遺傳改良提供了有效的技術(shù)手段。

1""材料與方法

1.1""材料

糜子品種為冀黍5號。含潮霉素抗性基因"（HPT）篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pRLG103_Predicted由Daniel"Voytas實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌DH5α感受態(tài)和農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)分別購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司和上海唯地生物技術(shù)有限公司。植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）購自天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶MIX購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；MS購自Duchefa"Biochemie公司；植物凝膠購自Caisson"Labs公司；潮霉素購自Gold"Biotechnology公司；蛋白胨和酵母粉購自O(shè)xoid公司；瓊脂糖購自Biowest公司；硫酸軟骨素鈉（軟骨素）購自北京璞棠生物科技有限公司生產(chǎn)。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2""方法

1.2.1""糜子的胚性愈傷誘導(dǎo)""選取經(jīng)休眠處理的冀黍5號的干燥成熟種子，去除種皮，將約2"g種子裝入50"mL無菌離心管中，用20"mL有效濃度為3%的次氯酸鈉溶液和50"μL吐溫20溶液，消毒滅菌處理20"min，用無菌水清洗多次后將種子接種于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。接種時注意種子芽點(diǎn)朝上，芽點(diǎn)不直接接觸培養(yǎng)基，每皿培養(yǎng)基接種子約20個，24"℃恒溫培養(yǎng)，濕度為55%，培養(yǎng)過程中先以12"h/12nbsp;h的光/暗培養(yǎng)模式進(jìn)行光照發(fā)芽，發(fā)芽后轉(zhuǎn)為暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)28"d后從芽點(diǎn)處挑取誘導(dǎo)的胚性愈傷組織，繼續(xù)暗培養(yǎng)7"d。使用2種胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM和MSD進(jìn)行糜子胚性愈傷誘導(dǎo)。CIM中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、七水合硫酸鋅0.035"g/L、五水合硫酸銅0.0006"g/L、激動素0.0005"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。MSD中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。

1.2.2""農(nóng)桿菌菌液的制備及活化""從–80"℃冰箱取出含載體pRLG103_Predicted（圖1）的AGL1農(nóng)桿菌菌株，置于LB培養(yǎng)基（蛋白胨10.0"g/L、酵母粉5.0"g/L、氯化鈉10.0"g/L和瓊脂粉15.0"g/L）上涂板活化，24"℃暗培養(yǎng)3"d，長出單菌落；挑取3個以上單菌落，同時置于含0.05"g/L的羧芐青霉素和0.05"g/L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于20"℃以200"r/min進(jìn)行震蕩培養(yǎng)24"h，離心得到新鮮的農(nóng)桿菌菌液。將新鮮的農(nóng)桿菌菌液加至侵染液中，搖晃進(jìn)行懸浮處理，得農(nóng)桿菌菌懸液，并用侵染液將農(nóng)桿菌菌懸液濃度調(diào)整到OD600值為0.6，然后于20"℃以100"r/min低速振蕩培養(yǎng)2～3"h進(jìn)行活化，得活化的農(nóng)桿菌菌液。侵染液中含有MS干粉2.2"g/L、蔗糖30"g/L、嗎啉乙磺酸1.0"g/L、乙酰丁香酮0.04"g/L和質(zhì)量體積比為0.1%的泊洛沙姆，pH"5.4。

1.2.3""侵染和共培養(yǎng)""將糜子的胚性愈傷誘導(dǎo)組織加至活化農(nóng)桿菌菌液中，按每30"mL活化農(nóng)桿菌菌液中加入60～80塊直徑約為0.5"cm糜子的胚性愈傷誘導(dǎo)組織的比例添加，于20"℃以120"r/min輕搖振蕩侵染60"min（振蕩侵染采用暗培養(yǎng)），侵染完成后，倒掉菌液，得經(jīng)侵染的糜子胚性愈傷組織。將經(jīng)侵染的糜子胚性愈傷組織倒在無菌濾紙上，吸干多余的菌液，并在超凈臺上適當(dāng)吹干，約30"min后轉(zhuǎn)接到放有無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，20"℃暗培養(yǎng)6"d，得共培養(yǎng)后糜子胚性愈傷組織。共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有MS干粉2.2"g/L、蔗糖30.0"g/L、嗎啉乙磺酸1.0"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L、激動素0.0005"g/L、乙酰丁香酮0.04"g/L和植物凝膠4.0"g/L，pH"5.4。

1.2.4""抗性愈傷的篩選""將共培養(yǎng)后糜子胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至愈傷篩選培養(yǎng)基上，每皿約20～30粒共培養(yǎng)后糜子胚性愈傷組織，24"℃暗培養(yǎng)2周，完成一次繼代，轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)2周（光照培養(yǎng)是于24"℃采用12"h/12"h光/暗培養(yǎng)），完成第二次繼代，整個共培養(yǎng)篩選過程繼代2次，每2周繼代1次，共培養(yǎng)篩選總用時1個月，得抗性愈傷組織。愈傷篩選培養(yǎng)基中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、七水合硫酸鋅0.035"g/L、五水合硫酸銅0.0006"g/L、激動素0.0005"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.002"g/L、植物凝膠9.0"g/L、特美汀0.5"g/L和潮霉素0.025"g/L，pH"5.8。

1.2.5""分化和生根""先從愈傷篩選培養(yǎng)基中將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至第一階段分化培養(yǎng)基中，于24"℃采用12"h/12"h的光/暗培養(yǎng)方式進(jìn)行光培養(yǎng)2周，再轉(zhuǎn)接至第二階段分化培養(yǎng)基中，24"℃采用12"h/12"h的光/暗培養(yǎng)方式進(jìn)行光培養(yǎng)2周，得苗高約2"cm的分化幼苗。將分化幼苗接入生根培養(yǎng)基中，于24"℃采用12"h/12"h的光/暗培養(yǎng)方式進(jìn)行生根培養(yǎng)1～2周得糜子的抗性再生植株。第一階段分化培養(yǎng)基中含有MS干粉4.4"g/L、蔗糖30.0"g/L、MS微量元素母液（1000′）1.0"mL/L、MS維生素（1000′）1.0"mL/L、6-芐氨基嘌呤0.003"g/L、激動素0.003"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.001"g/L、椰子水5%（V/V）、特美汀0.5"g/L、潮霉素0.015"g/L、稀釋5000倍的軟骨素1.0"mL/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。第二階段分化培養(yǎng)基中含有MS干粉4.4nbsp;g/L、蔗糖20.0"g/L、MS微量元素母液（1000′）1nbsp;mL/L、MS維生素（1000′）1"mL/L、6-芐氨基嘌呤0.001"g/L、激動素（KT）0.001"g/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.0005"g/L、椰子水5%（V/V）、特美汀0.5"g/L、潮霉素0.015"g/L、稀釋5000倍的軟骨素1.0"mL/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。生根培養(yǎng)基中含有MS干粉2.2"g/L、蔗糖15.0"g/L、MS微量元素母液（1000′）1.0"mL/L、MS維生素（1000′）1.0"mL/L、3-吲哚丁酸0.0005"g/L、特美汀0.5"g/L、潮霉素0.015"g/L和植物凝膠9.0"g/L，pH"5.8。

1.2.6""抗性再生植株的PCR鑒定""糜子的抗性再生植株用水洗掉培養(yǎng)基，移栽到植物培養(yǎng)箱中利用營養(yǎng)土進(jìn)行栽培，栽培過程中待轉(zhuǎn)基因植株長到20"cm高后，剪取葉片提取其基因組DNA。以上述DNA為模板，對抗性再生植株進(jìn)行了潮霉素抗性基因HPT和載體特異序列M1的PCR檢測，使用的檢測引物見表1。PCR檢測使用的酶為Taq"Mix，反應(yīng)體系為：無菌水9.5"μL、引物（10"μmol/L）各1.0"μL、Taq"Mix"12.5"μL、DNA模板1.0"μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5"℃預(yù)變性5"min；95"℃變性30"s，60"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，35個循環(huán)；72"℃延伸7"min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。根據(jù)不同批次的糜子轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)糜子的抗性再生植株的篩選效率和轉(zhuǎn)化效率。其中，篩選效率=PCR陽性的抗性再生植株數(shù)量/抗性再生植株數(shù)量×100%；轉(zhuǎn)化效率=PCR陽性的抗性再生植株數(shù)量/胚性愈傷誘導(dǎo)組織數(shù)量×100%。

2""結(jié)果與分析

2.1""糜子的胚性愈傷誘導(dǎo)

為考察添加細(xì)胞分裂素和生長素對愈傷組織形成的影響，在愈傷誘導(dǎo)階段設(shè)置了2種培養(yǎng)基CIM和MSD。結(jié)果表明，CIM和MSD培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)糜子胚性愈傷，但CIM誘導(dǎo)效率更高（圖2），表明KT的添加對糜子愈傷的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。糜子的胚性愈傷組織致密，非水漬狀，其在CIM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的不同階段的狀態(tài)見圖3。

2.2""抗性愈傷的篩選、分化和生根

糜子胚性愈傷在篩選培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2周后，糜子胚性愈傷會發(fā)生褐化，將糜子愈傷轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)2周，期間會有抗性愈傷的生長，抗性愈傷會分化出綠色的組織（圖4A），轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)會分化出糜子再生苗。將糜子再生苗幼苗接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)1～2周，即為抗性苗（圖4B）。具體生根培養(yǎng)時間根據(jù)幼苗大小決定，待生根完成后，得糜子的抗性再生植株，整個轉(zhuǎn)化周期約為12～16周。

2.3""糜子再生苗的PCR檢測

將糜子的抗性再生植株移栽到植物培養(yǎng)箱培養(yǎng)至約20"cm高時進(jìn)行PCR檢測，HPT和M1的檢測結(jié)果為陽性，即為抗性轉(zhuǎn)基因苗。多個糜子抗性再生植株的HPT和M1的PCR檢測結(jié)果如圖5所示，糜子的抗性再生植株都能擴(kuò)增出目的基因HPT和M1，而野生型對照（CK-）、DNA提取對照（CK1）和空白對照（CK2）均未擴(kuò)增出目的條帶，說明這些抗性再生植株均為轉(zhuǎn)基因陽性植株，目的載體已經(jīng)成功導(dǎo)入到糜子基因組中。根據(jù)3個批次的糜子轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)糜子的抗性再生植株的篩選效率和轉(zhuǎn)化效率（表2），結(jié)果表明，本方法獲得的糜子抗性再生植株的篩選效率為100%，平均轉(zhuǎn)化效率約為30.4%。

3""討論

糜子是起源于我國的最古老農(nóng)作物之一，曾經(jīng)是我國北方重要栽培作物，但隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，逐漸退出主栽作物地位成為區(qū)域特色作物，主要原因是糜子產(chǎn)量沒有大的突破，品質(zhì)沒有根本提升[9]。近年來，膳食結(jié)構(gòu)多樣化成為人們追求健康生活的需求，雜糧倍受重視，糜子作為藥食同源作物展現(xiàn)了新的種植前景[17]。因此，改良糜子品質(zhì)和提高糜子產(chǎn)量對糜子的產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展為糜子提供了快速有效的轉(zhuǎn)基因育種的途徑。

有效的遺傳轉(zhuǎn)化對于轉(zhuǎn)基因育種至關(guān)重要，但目前針對糜子的遺傳轉(zhuǎn)化方法僅在近3年開始有少量報(bào)道。2021年，申請?zhí)枮?02111531566.3的中國發(fā)明專利申請公開了一種黍?qū)僦参锏倪z傳轉(zhuǎn)化方法，其采用基因槍轟擊法獲得了糜子的轉(zhuǎn)基因植株[18]。但該方法可能引起突變、丟失和基因沉默等問題，不利于外源基因在糜子中穩(wěn)定表達(dá)，同時還具有操作復(fù)雜、命中率低、轉(zhuǎn)化效率低、育種成本高等缺點(diǎn)。2024年，研究者成功利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了糜子的基因編輯植株。LIU等[19]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因編輯載體導(dǎo)入糜子品種Hongmi的基因組中，以潮霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記獲得了八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因敲除的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)白化癥狀。此外，LU等[20]也利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因編輯載體導(dǎo)入糜子品種Longmi4的基因組中，以潮霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記獲得了Pmsd1敲除的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)明顯的矮化癥狀。雖然上述研究已經(jīng)通過基因槍法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了糜子的轉(zhuǎn)基因株系，但由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法受基因型的限制，不同品系的胚性愈傷誘導(dǎo)能力、農(nóng)桿菌侵染能力、愈傷脫分化能力均不同，導(dǎo)致不同品系的轉(zhuǎn)化效率也存在較大差異。因此，針對不同品種的糜子的遺傳轉(zhuǎn)化方法仍需進(jìn)行各項(xiàng)條件的摸索。

本研究以糜子品種冀黍5號的成熟種子為外植體，采用CIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)糜子胚性愈傷，以潮霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記經(jīng)過抗性愈傷的篩選、分化和生根獲得了糜子的轉(zhuǎn)基因植株。本研究建立的糜子遺傳轉(zhuǎn)化方法與上述糜子遺傳轉(zhuǎn)化研究[19-20]中的方法有諸多不同：上述研究中愈傷誘導(dǎo)使用的激素為2，4-二氯苯氧乙酸或2，4-二氯苯氧乙酸和6-芐氨基嘌呤，而本研究中使用的激素為2，4-二氯苯氧乙酸和激動素，有較高的愈傷誘導(dǎo)效率；上述研究中使用的農(nóng)桿菌均為EHA105，本研究使用的農(nóng)桿菌為AGL1，具有良好的侵染糜子

的效果；本研究在侵染培養(yǎng)液中添加了嗎啉乙磺酸和泊洛沙姆，起到穩(wěn)定侵染液pH的作用；LIU等[19]在糜子胚性愈傷分化時使用的激素是6-芐氨基嘌呤，而本研究經(jīng)過對分化培養(yǎng)基中的激素種類及比例的摸索，發(fā)現(xiàn)在分化階段使用2種分化培養(yǎng)基能獲得良好的分化效率，階段一和階段二培養(yǎng)基均含激素2，4-二氯苯氧乙酸、激動素和6-芐氨基嘌呤，只是含量上有變化，同時在分化培養(yǎng)基中添加了椰子水和軟骨素，也起到促進(jìn)愈傷分化的作用。LIU等[19]在糜子篩選抗性胚性愈傷時使用的潮霉素濃度為0.05"g/L，本研究中使用的潮霉素濃度為0.025"g/L，這可能是由于品種差異導(dǎo)致的。本研究建立的冀黍5號的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的抗性再生植株P(guān)CR鑒定的陽性率為100%，平均轉(zhuǎn)化效率30%以上，而LIU等[19]建立Hongmi的遺傳轉(zhuǎn)化方法的平均轉(zhuǎn)化效率僅為16.7%。

本研究建立了糜子品種冀黍5號的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化周期為12～16周，操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，成本低廉，且轉(zhuǎn)化不受季節(jié)限制，能規(guī)?；_展，為糜子品種的遺傳改良提供有效的技術(shù)手段。

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