通絡熄風湯通過調(diào)控Mst1/Sirt3信號通路對自發(fā)性高血壓大鼠心肌損傷程度的影響

摘要 目的：探討通絡熄風湯改善高血壓大鼠心肌損傷的作用機制。方法：6只Sprague-Dawley大鼠作為空白組，12只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為模型組和通絡熄風湯組?？瞻捉M和模型組大鼠給予去離子水灌胃，通絡熄風湯組給予中藥配方顆粒通絡熄風湯懸浮液灌胃治療，連續(xù)干預8周。采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌細胞中自噬受體蛋白1（SQSTM1/P62）、磷酸化哺乳動物無菌20樣激酶1（p-Mst1）、沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Sirt3）蛋白的含量，運用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織結構變化，以評價通絡熄風湯對高血壓心肌損傷改善的效果及機制。結果：與模型組比較，通絡熄風湯組能夠顯著改善高血壓大鼠的收縮壓及舒張壓（P＜0.01）。通絡熄風湯治療后大鼠心肌細胞與模型組比較，排列情況與壞死狀態(tài)均有明顯改善。通絡熄風湯組大鼠心肌組織中的p-Mst1、P62蛋白含量較模型組降低（P＜0.01），Sirt3蛋白含量升高（P＜0.01）。結論：通絡熄風湯可以介導Mst1/Sirt3信號通路對心肌組織細胞自噬水平進行調(diào)整，并且保護心臟功能。

關鍵詞 高血壓；心肌損傷；通絡熄風湯；細胞自噬；哺乳動物無菌20樣激酶1/沉默信息調(diào)節(jié)因子3信號通路

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.13.005

Effect of Tongluo Xifeng Decoction on Myocardial Injury in Spontaneously Hypertensive Rats by Regulating Mst1/Sirt3 Signaling Pathway

WANG Jisheng， LI Haisong， WANG Lu， GAO Ang， FENG Junlong， LI Haiyan， WU Yang， WANG Xian

Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

Corresponding Author " WANG Xian， E-mail： wx650515@163.com

Abstract Objective：To clarify the therapeutic effect" on hypertensive myocardial injury in rats.Methods：Six Sprague-Dawley rats were used as blank group，and 12 spontaneously hypertensive rats were randomly divided into model group and Tongluo Xifeng decoction group.Rats in blank group and model group were given deionized water intragastrically，and Tongluo Xifeng decoction group was given TCM formula granule Tongluo Xifeng decoction suspension intragastrically for 8 weeks.The contents of autophagy receptor protein 1（SQSTM1/P62），phosphorylated mammalian aseptic 20-like kinase 1（p-Mst1）and silence-information regulator 3（Sirt3）protein in cardiomyocytes were detected by Western Blot.The changes of myocardial tissue structure in rats were observed by hematoxylin-eosin（HE） staining to evaluate the effect" of Tongluo Xifeng decoction on hypertensive myocardial injury.Results：Compared with model group，Tongluo Xifeng decoction group could significantly improve systolic and diastolic blood pressure（P＜0.01）.After treatment with Tongluo Xifeng decoction，the arrangement and necrotic state of rat cardiomyocytes" significantly improved compared with that of" model group.The protein contents of P-MST1 and P62 in myocardial tissue of Tongluo Xifeng decoction group significantly decreased compared with that of model group（P＜0.01），while the protein content of Sirt3" significantly increased（P＜0.01）.Conclusion：Tongluo Xifeng decoction can mediate Mst1/Sirt3 signaling pathway to adjust the autophagy level of myocardial tissue cells and protect cardiac function.

Keywords hypertension; myocardial injury; Tongluo Xifeng decoction; autophagy; phosphorylated mammalian aseptic 20-like kinase 1/silence-information regulator 3 signaling pathway

高血壓是較常見的慢性病，也是導致殘疾和過早死亡的主要危險因素，其影響到全球近10億的成年人［1］。越來越多的研究表明，長期的血壓升高會引起一系列的心肌損傷，甚至導致心臟衰竭及心律失常［2］。盡管目前血壓的測量與調(diào)整越來越受到重視，降壓藥物不斷推陳出新，但對于血壓的控制仍差強人意。相關研究表明，全球范圍內(nèi)高血壓的發(fā)病率接近31.1%［3］。長期的血壓升高會不斷地對心、腦、腎等重要靶器官產(chǎn)生損害，最終危及生命。中醫(yī)藥能夠在控制血壓的同時，降低靶器官的損害，具有獨特的臨床優(yōu)勢［4］。

高血壓病人的臨床表現(xiàn)常以頭暈、頭疼為主，屬中醫(yī)學“眩暈”“頭痛”等范疇。絡病學派認為，高血壓及其他心血管疾病的主要致病因素為“絡風內(nèi)動”［5］。絡脈是人體內(nèi)一個龐大復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，能夠由內(nèi)聯(lián)通臟腑，至外聯(lián)通肌膚，是氣血津液疏布的基礎?！鹅`樞》中對于慢性疾病的進展有著相對詳細的描述：“是故虛邪之中人也，始于皮膚……留而不去，則傳舍于絡脈，在絡之時，痛于肌肉，其痛之時息，大經(jīng)乃代，留而不去，傳舍于經(jīng)……稽留而不去，息而成積，或著孫絡，或著絡脈”。說明了慢性疾病初起于肌膚，久則深入血絡。絡脈具有“多虛多瘀”的病理特點，其病變包括兩方面，即因虛致?。宏幪?、血虛等導致絡脈失于濡養(yǎng)；因

滯致?。禾禎?、瘀血、氣滯、寒凝等病理因素的聚集，阻塞絡脈，亦使絡脈失于濡養(yǎng)。痰濁瘀血相互搏結，日久反復難愈，從經(jīng)人絡，類似于《臨證指南醫(yī)案》中論述的“初病在經(jīng)，久病入絡，以經(jīng)主氣，絡主血”。絡脈為病，類似于西醫(yī)學的冠心病，在眾多致病因素的影響下，受累冠狀動脈脂質(zhì)沉積，伴隨斑塊形成，而后阻塞血流，導致心臟血供不足［6-7］。相關研究表明，運用活血通絡法，不僅可以對血壓進行調(diào)節(jié)，還可以預防靶器官損害，增加臨床療效［8］。通絡熄風湯組方包含水蛭、蜈蚣、當歸、牛膝等多味中藥。本研究通過觀察通絡熄風湯治療高血壓大鼠心肌細胞自噬水平的變化，探究通絡熄風湯對哺乳動物無菌20樣激酶1/沉默信息調(diào)節(jié)因子3（mammalian Ste20-like kinase 1/Silent information regulator 3，Mst1/Sirt3）通路的作用，進而探索其對高血壓心肌損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7～8周齡無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）級自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）12只和Sprague-Dawley（SD）SPF級大鼠6只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（北京）2021-0011S，體質(zhì)量260～310 g。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院SPF級動物房，晝夜交替各12 h，飼養(yǎng)環(huán)境濕度55%～60%，溫度22～26 ℃，采用去離子水和固體飼料適應性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物與試劑

通絡熄風湯為中藥配方顆粒，購于北京康仁堂藥業(yè)股份有限公司，組方：水蛭6 g，蜈蚣3 g，赤芍20 g，白蒺藜20 g，川牛膝15 g，當歸15 g，郁金10 g，青皮10 g，柴胡10 g，巴戟天15 g。將以上藥物研磨成粉末后充分溶解于去離子水中，調(diào)配實驗中要求的混懸液并保存于4 ℃冰箱中，實驗前充分混勻。蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（G1003）、自噬受體蛋白1（sequestosome 1，SQSTM1/P62）檢測試劑盒（GB11531）、Sirt3檢測試劑盒（GB11354）、ACTIN檢測試劑盒（GB11001）、RIPA裂解液（G2002-100ML）、二辛可酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（G2026-200T）購自Servicebio公司，p-Mst1檢測試劑盒（AP0906）購自Abclonal公司。

1.3 實驗儀器

普通光學顯微鏡（日本OlympusL340099），組織脫水機（日本櫻花Tissue-TekVIP5Jr），透射電子顯微鏡（日本HitachiH-7500），恒溫水浴箱（江蘇太倉市實驗設備廠），輪轉(zhuǎn)式組織切片機（德國LEICARM2255），包埋機（德國LEICA EG1160），石蠟切片機（德國LEICARM2135），染色機（德國LEICAST5010），精密電子天平（MettlerAE160），低溫高速離心機（Germany MIKR002R），組織攤烤片機（浙江益迪YD-AB），pHMrter日本TOAHM-20E，電子秤。

1.4 實驗分組

所有大鼠適應喂養(yǎng)7 d后，將6只SD大鼠作為空白組；將12只SHR大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組和通絡息風湯組，每組6只。通絡熄風湯組大鼠給予通絡熄風湯中藥顆粒懸漿15.6 g/kg灌胃（人體用量的6倍），空白組和模型組給予去離子水灌胃，每日2次，連續(xù)干預8周。

1.5 收縮壓（systolic pressure，SBP）和舒張壓（diastolic pressure，DBP）測量

分別于干預第2周、第4周、第6周、第8周使用無創(chuàng)血壓儀（BP-300A，成都泰盟，中國）檢測各組大鼠的尾動脈SBP和DBP。在室溫條件下，在大鼠安靜、清醒狀態(tài)下，待血流波形穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)，共記錄5組，去掉最高值和最低值，取平均值。

1.6 組織學分析

收集并清洗大鼠心臟組織，將一部分心臟包埋在石蠟中，切成5 μm薄片，HE染色并切片，進一步觀察標本并在配備數(shù)碼管的光學顯微鏡下拍照（奧林巴斯BX51TF，日本東京）。取1 mm長的心臟組織并固定。

1.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠心肌組織p-Mst1、Sirt3和P62蛋白含量

取冷凍保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白。采用BCA法進行蛋白定量，每孔30 μg蛋白質(zhì)上樣，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入p-Mst1、Sirt3和P62一抗，過夜，加入二抗（1∶5 000），孵育1 h后，采用增強型化學發(fā)光試劑（ECL）顯色，計算條帶的相對表達。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方法分析（one-way ANOVA），方差齊性檢驗采用Brown-Forsythe檢驗，組間比較采用Tukey′s多重比較檢驗。定性資料以例數(shù)、百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 通絡熄風湯對各組大鼠SBP和DBP水平的影響

與空白組相比，模型組SBP和DBP水平顯著升高（P＜0.01）。治療后，通絡熄風湯組大鼠SBP和DBP較模型組降低（P＜0.01）。重復測量方差分析結果顯示，SBP和DBP以時間因素和分組的交互作用、時間因素均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），通絡熄風湯組治療后各時間段的SBP和DBP更低（P＜0.01）。

詳見圖1。

2.2 通絡熄風湯對大鼠心肌病理形態(tài)的影響

空白組大鼠心肌組織排列整齊、染色均勻，無心肌細胞壞死；模型組大鼠染色不均，細胞形態(tài)不規(guī)則，可見大量炎性浸潤以及灶性壞死；經(jīng)通絡熄風湯治療后，大鼠心肌組織較模型組炎性浸潤減少，排列整齊，壞死情況改善。詳見圖2。

2.3 通絡熄風湯對大鼠心肌超微結構的影響

空白組心肌纖維排列規(guī)整，線粒體結構清晰，形態(tài)較規(guī)整，嵴密集；模型組肌絲排列紊亂，線粒體結構破壞或分裂，嵴減少，并可見大量的自噬小體；經(jīng)通絡熄風湯治療，心肌纖維排列得到改善，線粒體結構恢復，自噬小體數(shù)量減少。詳見圖3。

2.4 通絡熄風湯對大鼠心肌組織中p-Mst1、Sirt3和P62蛋白含量的影響

與空白組相比，模型組大鼠心肌組織中Sirt3蛋白表達水平下降（P＜0.01），p-Mst1和P62蛋白表達水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，通絡熄風湯組大鼠心肌組織中Sirt3蛋白含量升高（P＜0.01），p-Mst1和P62蛋白含量降低（P＜0.01）。詳見圖4、圖5。

3 討 論

長期高血壓所累積的兒茶酚胺和血管緊張素等可損傷心肌細胞，導致脂質(zhì)在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)膜下沉積，造成粥樣硬化的發(fā)生［9］。高血壓導致的心肌損傷會顯著提高心源性猝死的風險，嚴重影響病人的身心健康，臨床中已受到廣泛關注［10］。近年來，中醫(yī)藥在高血壓及其并發(fā)癥的臨床治療上具有確切的療效，在改善病人血壓水平的同時，還能夠減緩心肌損傷，保護循環(huán)功能，且毒副作用較?。?1-12］。高血壓屬中醫(yī)“眩暈”“頭痛”等疾病范疇，病位在絡脈。病機以脈絡失養(yǎng)為基礎，隨著疾病遷延演變，逐漸出現(xiàn)心脈瘀阻；發(fā)展至心肌損害階段則病機多以脈絡瘀阻為主，不通則痛，發(fā)作時脈絡攣急，可痛徹胸背。

通絡熄風湯組成包括：水蛭、蜈蚣、赤芍、白蒺藜、川牛膝、當歸、郁金、青皮、柴胡、巴戟天。通絡熄風湯從絡論治，活血化瘀，兼顧益氣、疏肝等。方中水蛭破血逐瘀，通經(jīng)消癥；蜈蚣性善走竄，息風通絡，二者同用，配合牛膝、赤芍、郁金化瘀生新，起到促進血液循環(huán)，改善心肌功能的效果?；钛幬锱浜锨嗥?、當歸、柴胡、白蒺藜疏肝理氣，行氣而助活血之功，兼治氣滯血瘀諸癥。相關研究表明，方中白蒺藜中的蒺藜皂苷［13］和當歸中的5-羥甲基糠醛、腺苷［14］等成分，都有一定的降血壓作用。諸藥合用，共奏活血通絡、息風止痙之功效。

真核細胞通過雙層膜結構的自噬小泡吞噬異常細胞器和無用脂質(zhì)、蛋白質(zhì)并降解從而實現(xiàn)自身代謝及更新細胞器的功能［15-16］。自噬的過程對保持細胞形態(tài)及功能具有重要意義，正常細胞自噬功能能夠起到維持心臟構造和保護心肌完整性的作用。當自噬功能長期異常時，將導致心肌大面積壞死［17-18］。相關研究表明，過度自噬可能是擴張型心肌?。―CM）的發(fā)生機制之一，通過對細胞自噬進行抑制，可在一定程度上改善心功能［19-20］。P62又稱SQSTM1，是一種選擇性自噬受體。當自噬反應激活時，P62受到分解；當自噬受到抑制，P62蛋白將逐漸蓄積。本研究中，模型組細胞自噬水平顯著高于空白組，應用通絡熄風湯的大鼠心肌細胞自噬水平受到抑制。

Hippo通路與減少細胞增殖、增強細胞凋亡、組織發(fā)育、腫瘤生長調(diào)節(jié)功能緊密相連［21-22］。Mst1是Hippo通路中的核心激酶之一，具有介導Yap-Hippo信號軸促進細胞凋亡以及調(diào)控細胞自噬水平的作用［23］。Sirt3是一種沉默信息調(diào)節(jié)因子，可以促使FOXO1產(chǎn)生去乙?；?，從而抑制氧化應激反應及細胞凋亡［24］。本研究中，通絡熄風湯能夠顯著改善自發(fā)性高血壓大鼠SBP和DBP，降低心肌組織中p-Mst1和P62蛋白含量，升高Sirt3蛋白表達水平，這為高血壓心肌損傷的治療提供了新的思路。

綜上所述，通絡熄風湯可以介導Mst1/Sirt3信號通路對心肌組織細胞自噬水平進行調(diào)整，并且保護心臟功能。但本研究仍存在一定局限性，Mst1/Sirt3屬于多功能、多靶點通路，通絡熄風湯對高血壓心肌損傷的保護作用相關機制仍需進一步探討。

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（收稿日期：2022-08-03）

（本文編輯鄒麗）

基金項目 中國博士后創(chuàng)新人才支持計劃（No.BX20220047）

通訊作者 王顯，E-mail：wx650515@163.com

引用信息 王繼升，李海松，王璐，等.通絡熄風湯通過調(diào)控Mst1/Sirt3信號通路對自發(fā)性高血壓大鼠心肌損傷程度的影響［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（13）：2342-2346.