1株拮抗禾谷鐮刀菌生防菌株的篩選鑒定

摘要：為有效預(yù)防由禾谷鐮刀菌引起的作物病害，提供生物防治新資源，篩選并鑒定可以有效抑制禾谷鐮刀菌的生防菌。采用稀釋平板法從小麥生境中分離菌株，以禾谷鐮刀菌為指示菌，利用平板對(duì)峙法篩選生防菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、菌株生理生化檢測(cè)以及16S rDNA、gyrB基因序列分析對(duì)生防菌株進(jìn)行鑒定，并檢驗(yàn)其對(duì)5種植物病原真菌的抑菌效果，測(cè)定其抑菌范圍。篩選出1株對(duì)禾谷鐮刀菌具有明顯抑菌作用的菌株B2-211022-01，抑菌率為5795%，其菌落形態(tài)、生理生化特征與芽孢桿菌相一致，通過(guò)序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，該菌株的16S rDNA、gyrB基因序列與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）同源性最高，分別為99.9%、100.0%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果顯示，菌株B2-211022-01與貝萊斯芽孢桿菌屬于一個(gè)分支，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌，該菌株除了能抑制禾谷鐮刀菌外，還對(duì)冬瓜枯萎病病菌、芍藥灰霉病病菌、番茄灰霉病病菌、牡丹炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌等5種供試植物病原真菌表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑菌范圍較廣，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有一定的病害防治潛力。

關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌；生物防治；貝萊斯芽孢桿菌；抑菌作用；生防菌株

中圖分類號(hào)：S432.4+4；S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）11-0128-06

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是一種主要侵染小麥、玉米等禾本科作物的病原真菌，由其引起的病害在全球范圍內(nèi)廣泛存在，感染作物后產(chǎn)生的真菌毒素不僅損害作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還會(huì)引發(fā)糧食安全問(wèn)題，給人畜健康造成嚴(yán)重威脅［1-2］。近年來(lái)，受氣候、秸稈還田等影響，一些由禾谷鐮刀菌引起的病害，如小麥赤霉病在我國(guó)愈發(fā)嚴(yán)重，且呈從南方逐步向北方擴(kuò)散的態(tài)勢(shì)［3］。目前，針對(duì)這種病害的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥。然而，長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及耐藥菌的出現(xiàn)等問(wèn)題［4-6］。因此，尋求一種可持續(xù)的、環(huán)境友好的控制方案是未來(lái)發(fā)展的方向。生物防治作為一種安全、環(huán)境友好、效果明顯的防治手段，在綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展方面愈發(fā)受到重視，其中開(kāi)發(fā)新型天然拮抗微生物是生物防治的有效途徑，對(duì)保障糧食安全具有重要意義。

筆者所在課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)蒙古赤峰市小麥種植基地，未施用農(nóng)藥的部分農(nóng)田出現(xiàn)小麥赤霉病害，而與之相鄰田塊的植株并未發(fā)病且長(zhǎng)勢(shì)良好，推測(cè)在該地區(qū)未發(fā)病作物生長(zhǎng)環(huán)境中可能存在抑制禾谷鐮刀菌的生防菌株。因此，本研究從未施用農(nóng)藥且長(zhǎng)勢(shì)良好的小麥生境中進(jìn)行取樣，通過(guò)稀釋平板法分離篩選對(duì)禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)拮抗作用的生防菌株，利用形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及分子生物學(xué)方法對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行鑒定，并初步探究其抑菌廣譜性，以期為由禾谷鐮刀菌等引起的真菌病害提供新的生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)病植株、未發(fā)病植株及根際土壤樣品于2021年5—6月采集自內(nèi)蒙古赤峰市松山區(qū)小麥種植基地。供試菌株為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）、牡丹炭疽病病菌（Gloeosporium sp.）、芍藥灰霉病病菌（Botrytis paeoniae）、番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea）、冬瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum f. sp. benincasae），均由赤峰學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保藏，經(jīng)活化后備用。所用培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基均購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。后續(xù)試驗(yàn)（2021年9月至2022年12月）在赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱（SHP-1500型，金壇市金祥龍電子公司）、超凈工作臺(tái)（VS-1300L-U型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、生物顯微鏡（BX53F型，OLYMPUS公司）、高壓滅菌器（HVE-50型，HIRAYAMA公司）、電子天平（BSA224型，賽多利斯科學(xué)儀器公司）、搖床恒溫培養(yǎng)箱（LYZ-2102C型，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離

采用稀釋平板法［7］分離菌株，具體操作步驟：將在小麥赤霉病發(fā)生期間采集的發(fā)病植株、未發(fā)病植株及根際土壤樣品分別置于三角瓶中，加入9倍質(zhì)量的無(wú)菌水，于25 ℃、150 r/min條件下振蕩30 min，取上清液，加入無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，配制成不同濃度的稀釋液，取100 μL稀釋液涂布于TSA培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下避光培養(yǎng)24 h后，挑選形態(tài)差異顯著的菌落進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生防菌的篩選

采用平板對(duì)峙法［8］篩選生防菌株，具體操作步驟：將分離得到的單菌落于 28 ℃、180 r/min條件下在NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng) 12 h，使菌液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度（D600 nm）為10，得生防菌液。在培養(yǎng)5 d的禾谷鐮刀菌菌落邊緣挑取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板培養(yǎng)基中央位置，以菌餅為中心，在距離菌餅3 cm處點(diǎn)接 1 μL 生防菌液，以無(wú)菌水為對(duì)照，在28 ℃條件下培養(yǎng)4 d后，采用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.3 菌體形態(tài)特征觀察

選取拮抗禾谷鐮刀菌效果最好的菌株，在TSA培養(yǎng)基上純化后，放置在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。對(duì)純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.2.4 生理生化測(cè)定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［9］測(cè)定生防菌株的生理生化指標(biāo)。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定

取純化后的菌株樣品，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA、gyrB基因序列測(cè)定，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)，并在MEGA 11.0軟件中采用鄰接法［10］進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.6 生長(zhǎng)曲線的繪制

將生防效果最好的菌株B2-211022-01按1％的接種量接種于NB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h，每3 h檢測(cè)1次樣品的D600 nm，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600 nm為縱坐標(biāo)，繪制B2-211022-01菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 對(duì)5種植物病原真菌的拮抗作用

將B2-211022-01菌株接入NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，采用平板對(duì)峙法對(duì)除禾谷鐮刀菌外的其他5種植物病原真菌進(jìn)行抑菌效果測(cè)定，以評(píng)價(jià)其抑菌范圍，測(cè)定方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2019和DPS 15.10軟件，采用Duncan’s新復(fù)極差法在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌分離篩選及拮抗效果

通過(guò)分離得到47株菌株，將其分別編號(hào)為 B2-211022-01～B2-211022-47，以禾谷鐮刀菌為指示菌，篩選出有較強(qiáng)拮抗作用的菌株2株（B2-211022-01和B2-211022-05），其中菌株B2-211022-01的抑菌效果最好，抑菌率為57.95%（圖1）。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定

將B2-211022-01菌株于28 ℃條件下在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)果（圖2）顯示，該菌菌落近圓形，邊緣不規(guī)則，顏色淺黃，不透明，表面濕潤(rùn)。在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌體呈桿狀，大小為（0.6～0.8） μm×（1.9～2.8） μm，單個(gè)或成對(duì)排列，柱形芽孢，近端生，胞囊不膨大，革蘭氏陽(yáng)性。這一形態(tài)特征與芽孢桿菌一致，因此鑒定B2-211022-01為芽孢桿菌。

生理生化鑒定結(jié)果（表1）表明，該菌可水解七葉苷，利用肌醇、D-甘露糖、D-葡萄糖、糖原、D-甘露醇、D-核糖、D-海藻糖；不能利用麥芽三糖、D-松三糖、D-半乳糖等；具有β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳氨酶、ɑ-半乳糖苷酶、甘氨酸芳氨酶、α-葡萄糖苷酶、丙氨酸芳氨酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳氨酶等活性；丙酮酸鹽反應(yīng)、紅四氮唑試驗(yàn)呈陽(yáng)性；在6.5%氯化鈉溶液中可以生長(zhǎng)，對(duì)卡那霉素、多黏菌素B敏感，而對(duì)竹桃霉素具有抗性。這與文獻(xiàn)［11-13］中對(duì)貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）生理生化特性的描述基本一致，依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［9］，結(jié)合菌株形態(tài)特征，初步鑒定B2-211022-01菌株為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以供試菌株B2-211022-01的基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增其16S rDNA、gyrB基因片段，獲得長(zhǎng)度分別為1 396、1 098 bp的序列，通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)序列與貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）對(duì)應(yīng)序列的同源性分別為99.9%、100.0%。通過(guò)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，菌株B2-211022-01的16S rDNA、gyrB序列與貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）聚于一支（圖3）。因此，進(jìn)一步確定菌株B2-211022-01為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。

2.4 菌株B2-211022-01生長(zhǎng)曲線測(cè)定

為進(jìn)一步了解菌株的生長(zhǎng)特性，對(duì)菌株B2-211022-01的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖4）表明，B2-211022-01菌株的生長(zhǎng)遲緩期相對(duì)較短，其對(duì)數(shù)期為培養(yǎng)6～12 h， 培養(yǎng)15～27 h為穩(wěn)定生長(zhǎng)期且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，27 h后進(jìn)入衰退期。因此，采用培養(yǎng)12 h的菌液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

2.5 菌株B2-211022-01對(duì)5種植物病原菌的拮抗作用

為檢測(cè)菌株B2-211022-01的抑菌廣譜性，以5種植物病原菌為供試菌，進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)，結(jié)果（表2、圖5）表明，菌株B2-211022-01對(duì)5種植物病原真菌均有較好的抑制作用，尤其對(duì)番茄灰霉病病菌抑制效果最明顯，抑菌率達(dá)到68.85%，而對(duì)芍藥灰霉病病菌的抑制作用相對(duì)較弱，抑菌率為30.01%。

3 結(jié)論與討論

本研究從小麥生境中分離純化得到1株對(duì)禾谷鐮刀菌有明顯拮抗作用的生防菌株B2-211022-01，該菌株的形態(tài)特征以及生理生化特性與芽孢桿菌相一致，菌株的16S rDNA、gyrB基因序列與貝萊斯芽孢桿菌同源性最高，分別為99.9%、100.0%，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果顯示，菌株B2-211022-01與貝萊斯芽孢桿菌屬于一個(gè)分支，因此，綜合3個(gè)方面的結(jié)果，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。

近年來(lái)，有研究者利用生防菌防治由禾谷鐮刀菌引起的植物病害，其中應(yīng)用較為廣泛的菌株為芽孢桿菌和假單胞桿菌，木霉、酵母和其他細(xì)菌也有一定防治效果［14］。如李艷情等發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）及其活性代謝產(chǎn)物脂肽類化合物對(duì)由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病有強(qiáng)烈的抑制作用［15］。張強(qiáng)等從河南地區(qū)蔬菜大棚采集的土樣中分離純化出1株鏈霉菌，該菌的孢子能抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)［2］。亓文哲等發(fā)現(xiàn)，死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）TA-1能抑制禾谷鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)［16］。Sun等發(fā)現(xiàn)，桿菌霉素D對(duì)受污染的小麥中禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)能起到明顯抑制作用，抑制率可達(dá)94.6%［17］。楊楠從小麥生境中分離篩選得到1株綠針假單胞菌PC60，發(fā)現(xiàn)其對(duì)禾谷鐮刀菌有強(qiáng)烈的抑制作用［14］。孫露發(fā)現(xiàn)，從土壤中篩選的特基拉芽孢桿菌WRN032對(duì)禾谷鐮刀菌具有一定的抑制作用［18］。本研究所篩選出的貝萊斯芽孢桿菌B2-211022-01在試驗(yàn)條件下對(duì)禾谷鐮刀菌有良好的拮抗效果，抑菌率為57.95%，可作為一種抑制禾谷鐮刀菌的生防菌資源。

作為在自然界中普遍存在的一種芽孢桿菌，貝萊斯芽孢桿菌在1999年被首次分離，2005年得以被命名和報(bào)道，其分布范圍涵蓋了植物組織、河水、土壤和海洋等多種環(huán)境［19］。目前，對(duì)于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性、拮抗病原菌及其機(jī)制等方面［20-21］。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌不僅可以分泌多種廣譜抗菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物［22-23］，還具有提高植物抗性［24］、促進(jìn)植物生長(zhǎng)［25］等作用。目前一些菌株已經(jīng)應(yīng)用于甜櫻桃軟腐?。?6］、花生莖腐?。?7］等植物病害的防治工作中。本研究分離鑒定的菌株B2-211022-01對(duì)禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，同時(shí)平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)冬瓜枯萎病病菌、黃瓜枯萎病病菌、番茄灰霉病病菌、牡丹炭疽病病菌等5種植物病原真菌也具有抑制效果，說(shuō)明該菌株抑菌譜較廣，在開(kāi)發(fā)新型的復(fù)合生物拮抗劑方面具有一定的應(yīng)用潛力。

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