16S rRNA甲基化酶基因在雞源和鴨源沙門菌中的流行特征

摘要：氨基糖苷類藥物是一種重要的治療人獸臨床上細(xì)菌感染的抗菌藥物，而16S rRNA甲基化酶是近年新發(fā)現(xiàn)的氨基糖苷類藥物高度耐藥的一種耐藥機(jī)制。對2021—2022年分離自泰州雞源和鴨源的143株沙門菌進(jìn)行阿米卡星抗性平板篩選，并通過PCR方法檢測耐阿米卡星的菌株是否攜帶相應(yīng)的耐藥基因。結(jié)果顯示，沙門菌中armA基因較流行（22/143，15.38%），也有少數(shù)菌株攜帶rmtB基因（1/143，0.70%），其他基因未檢測到；不同宿主中，雞源沙門菌是主要宿主；不同血清型中，印第安納沙門菌是優(yōu)勢血清型。攜帶armA基因或rmtB基因的23株陽性菌，阿米卡星的MIC值均高達(dá)512 μg/mL以上，且表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，其中，較為流行的耐藥譜是氨芐西林-頭孢唑啉-氨曲南-慶大霉素-阿米卡星-萘啶酸-環(huán)丙沙星-氯霉素-喹乙醇-復(fù)方新諾明-頭孢噻肟-鏈霉素-四環(huán)素-氟苯尼考-磷霉素。國內(nèi)外關(guān)于16S rRNA甲基化酶基因在沙門菌中的研究相對較少。本研究結(jié)果可為生產(chǎn)實踐中耐藥菌株的快速監(jiān)測提供參考，也可為動物臨床或養(yǎng)殖業(yè)中合理使用氨基糖苷類藥物提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞源；鴨源；沙門菌；16S rRNA甲基化酶基因；耐藥性

中圖分類號：S852.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0061-06

現(xiàn)全球普遍發(fā)現(xiàn)抗生素耐藥的現(xiàn)象，據(jù)《全球抗菌藥物耐藥回顧》報告，至2050年，每年有1 000萬人因細(xì)菌耐藥而死亡并累計造成100萬億美元的經(jīng)濟(jì)損失；即使現(xiàn)在，每年仍有70萬人死于細(xì)菌耐藥［1］。另外，抗生素在動物臨床或養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛而長期不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生，并通過密切接觸等方式將耐藥菌/基因傳播給人。

氨基糖苷類抗菌藥物，逐漸成為藥物研究及臨床應(yīng)用所關(guān)注的焦點，它可通過抑制正常的蛋白質(zhì)合成從而達(dá)到抑菌效果［2］。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可分為3種：第1種是4，6-雙取代的二脫氧鏈霉胺（DOS），如阿米卡星等；第2種是4，5-雙取代的DOS，如新霉素等；第3種是 4-單取代的DOS，如安普霉素等［3］。氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制主要有4種：（1）細(xì)胞壁通透性的改變；（2）外排泵將氨基糖苷類藥物從胞質(zhì)向外擴(kuò)增流出；（3）氨基糖苷類鈍化酶的產(chǎn)生；（4）16S rRNA甲基化酶的出現(xiàn)，是質(zhì)粒介導(dǎo)的一種耐藥機(jī)制［4］。

沙門菌（Salmonella）是一類對人類和動物均具有極大危害的革蘭氏陰性腸道致病菌，它可進(jìn)行多種途徑傳播（環(huán)境、食物鏈等）［5］?，F(xiàn)在沙門菌的耐藥譜越來越廣，耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，多重耐藥（multi-drug resistant，MDR）或幾乎對所有藥物耐藥的沙門菌不斷出現(xiàn)并被報道［6］。氨基糖苷類藥物由于藥效良好，被廣泛用于革蘭氏陰性菌所致疾病的治療，而16S rRNA甲基化酶是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的氨基糖苷類藥物的耐藥機(jī)制，可介導(dǎo)高水平耐藥。因此，有必要研究16S rRNA甲基化酶基因在沙門菌中的流行特征，這對延緩氨基糖苷類耐藥性的產(chǎn)生具有重要意義。

1 材料方法

1.1 試驗材料

檢測2021—2022年泰州禽源143株沙門菌，其中，雞源沙門菌97株、鴨源沙門菌46株。質(zhì)控菌ATCC 25922由筆者所在實驗室保存。試驗所用試劑和儀器詳見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離、純化、鑒定和保存

1.2.1.1 細(xì)菌分離和純化 按1 ∶25的比例向采集的樣品中加入BPW肉湯進(jìn)行增菌，30 ℃恒溫，100 r/min，培養(yǎng)20～24 h；按1 ∶9的比例向RVR10肉湯中加入BPW增菌液，42 ℃靜置培養(yǎng)，蘸取RVR10肉湯，三區(qū)劃線于XLT4培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)約24 h，初步挑選疑似沙門菌的菌落（中心黑色，周圍有透明暈環(huán)），進(jìn)行純化，之后進(jìn)行生化鑒定，于LB平板上保存結(jié)果為陽性的菌落待用。

1.2.1.2 細(xì)菌生化鑒定

參照梅里埃API 20試劑盒說明書進(jìn)行操作，依據(jù)結(jié)果判讀表及食品數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.1.3 細(xì)菌種屬鑒定

（1）DNA制備：挑取單菌落劃滿板于LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，采用 500 μL 滅菌0.85%生理鹽水懸浮刮取適量的菌落，100 ℃金屬浴15 min，13 200 r/min離心5 min，收集上清，-20 ℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）引物合成：引物由金斯瑞生物科技有限公司（南京）進(jìn)行合成（表2）。25 μL PCR反應(yīng)體系見表3。PCR運行程序如下：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃保持 10 min。

（3）結(jié)果判定：取8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，以DL 2 000作參照，同時設(shè)立陽性和陰性對照，在紫外檢測儀下觀察結(jié)果。

1.2.1.4 血清型鑒定

參照食品國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》介紹的方法及 Kaufmann-White方法對沙門菌進(jìn)行血清型分型［5］。

1.2.1.5 細(xì)菌保存

選取生化實驗符合沙門菌特性且PCR擴(kuò)增為陽性的菌株進(jìn)行凍存，配制含終濃度為30%甘油的TSB凍存液，吸取3 mL置于采用單菌涂滿板的LB固體培養(yǎng)基上，刮菌、混勻，分裝至2個無菌凍存管中，做好標(biāo)記，保存于-70 ℃冰箱。

1.2.2 藥物敏感性測定

采用瓊脂稀釋法檢測26株阿米卡星耐藥沙門菌的藥物敏感性。

1.2.2.1 藥物配制

按照（Cinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)［7］選取相應(yīng)抗生素的溶劑進(jìn)行配制。采用濾膜（0.22 μm）過濾，測定質(zhì)控菌ATCC 25922的MIC值，分裝在質(zhì)控內(nèi)的藥物放至-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 最小抑菌濃度（MIC）測定

（1）瓊脂稀釋平皿的制備：藥物體積為1 mL，加入19 mL MH瓊脂，體積比為1 ∶[KG-*3]19，接種前后的空白對照應(yīng)為無抗的MH平板，晾干平板后正放備用。

（2）菌液的制備：接種單菌落至MH肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，使菌液達(dá)0.5個D值，最后在96孔板中稀釋成1×106 CFU/mL。

（3）接種菌液：使用多點接菌儀將菌液接種到MH瓊脂平板上，整個試驗過程，以質(zhì)控菌ATCC 25922菌株作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。菌液晾干后，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h，觀察實驗結(jié)果。

1.2.2.3 結(jié)果判定

對lt;6個單菌落的判定為抑制生長；若出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象，認(rèn)定以能最高抑制細(xì)菌生長的藥物濃度，若發(fā)現(xiàn)多次跳孔或者不在質(zhì)控范圍內(nèi)，則需重新試驗。抗菌藥物的分類、縮寫和耐藥折點見表4。

1.2.3 16S rRNA甲基化酶基因的檢測

引物設(shè)計后，由金斯瑞生物科技有限公司（南京）進(jìn)行合成（表5）；25 μL PCR反應(yīng)體系見表3；各引物的PCR反應(yīng)運行參數(shù)見表6。將PCR產(chǎn)物送至擎科生物有限公司（南京）進(jìn)行測序，結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov）比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門菌血清型分型結(jié)果

本研究對143株家禽來源的沙門菌進(jìn)行血清型分型，結(jié)果（表7）表明，成功分型出5種血清型。由表8可知，雞源沙門菌的血清型主要為鼠傷寒沙門菌（29.90%，29/97），印第安納沙門菌（24.74%，24/97）和腸炎沙門菌（32.99%，22/97）；鴨源沙門菌的血清型為鼠傷寒沙門菌（52.17%，24/46）和腸炎沙門菌（47.83%，22/46）。

2.2 16S rRNA甲基化酶基因的檢測結(jié)果

本研究對143株沙門菌進(jìn)行阿米卡星抗性平板的篩選，結(jié)果（圖1）表明，共有23株沙門菌對阿米卡星耐藥，經(jīng)PCR檢驗發(fā)現(xiàn)均攜帶16S rRNA甲基化酶基因，表型與基因型對應(yīng)性為100%；其中，有22 株沙門菌攜帶armA基因， 陽性率為（22/143，15.38%）；1株沙門菌攜帶rmtB基因，陽性率為070%（1/143）。

由表9可知，不同宿主來源沙門菌中，僅在雞源沙門菌（23.71，23/97）中檢測到16S rRNA甲基化酶基因，而在鴨源沙門菌中未檢測到，armA基因檢出率為22.68%（22/97），rmtB基因檢出率為103%（1/97）。由表10可知，不同血清型沙門菌中，僅在印第安納沙門菌中檢測到16S rRNA甲基化酶基因，檢出率最高（85.71%，23/24），其余血清型中均未檢測到。

2.3 攜帶16S rRNA甲基化酶基因菌株的藥物敏感性結(jié)果

23株攜帶armA/rmtB基因的沙門菌對18種抗菌藥物敏感性見圖2。由圖2可知，對阿米卡星、慶大霉素、氨曲南、頭孢唑啉、氨芐西林、復(fù)方新諾明、萘啶酸、氯霉素、環(huán)丙沙星和喹乙醇100%耐藥，對頭孢噻肟、磷霉素和氟苯尼考的耐藥率均高于90%，對鏈霉素和四環(huán)素80%耐藥，耐藥率較低的是呋喃妥因和多黏菌素（lt;5%），所有菌株均對美羅培南敏感，耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。

23株攜帶armA/rmtB基因的沙門菌均對3類及3類以上的抗菌藥物表現(xiàn)耐藥。由表11可知，多重耐藥率達(dá)100%，其中，3株沙門菌對9類藥物耐藥（3/23，13.04%），19株沙門菌對10類藥物耐藥（19/23，82.61%），1株沙門菌對11類藥物耐藥（1/23，4.35%）。最流行的多重耐藥譜為：氨芐西林-頭孢唑啉-氨曲南-慶大霉素-阿米卡星-萘啶酸-環(huán)丙沙星-氯霉素-喹乙醇-復(fù)方新諾明-頭孢噻肟-鏈霉素-四環(huán)素-氟苯尼考-磷霉素，占總多重耐藥譜系的70.83%。

3 討論

作為治療革蘭氏陰性菌常用藥物之一的氨基糖苷類藥物，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)和人醫(yī)臨床，而16SrRNA[JP+2]甲基化酶是一種新的氨基糖苷類耐藥機(jī)制，16S rRNA甲基化酶耐藥菌株的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了抗感染治療的效果，限制了臨床細(xì)菌感染治療的藥物選擇。16S rRNA甲基化酶基因在全球不同來源革蘭氏陰性菌中廣泛傳播，其中，以armA和rmtB基因最為流行［9］；在沙門菌中也陸續(xù)有所報道，在我國禽源沙門菌中檢測armA、rmtB、rmtC和rmtD基因，鴨源以rmtB基因為主，雞源以armA基因為主，優(yōu)勢血清型為印第安納沙門菌，在臨床嬰兒沙門菌中發(fā)現(xiàn)rmtC基因；另外在法國臨床分離出的維爾肖沙門菌、阿爾及利亞沙門菌，臨床分離出的嬰兒沙門菌和印度洋法屬留尼汪島動物源性食品中分離出的鼠傷寒變異株中檢測到armA基因，在美國臨床分離出的斯坦利沙門菌和維爾肖沙門菌中檢測到armA和rmtC基因，在英國臨床和動物源性食品中分離出的維爾肖沙門菌中檢測到rmtC基因，在非洲臨床樣品中分離出的鼠傷寒沙門菌中檢測到rmtB基因。

沙門菌中armA基因較流行（22/143，1538%），也有少數(shù)菌株攜帶rmtB基因（1/143，070%）。在阿爾及利亞的一家醫(yī)院分離的沙門菌，armA基因的檢出率為8.61%，美國醫(yī)院收集的18 281株沙門菌，armA和rmtC基因的檢出率低于1%。我國幾家鴨場收集的2 163份樣品中，armA基因的檢出率為0.05%，rmtB基因的檢出率為055%；非洲430份食品動物源性食品樣品中檢測到rmtB基因，檢出率為1.16%；我國從臨床、市售雞肉及內(nèi)臟等1 540份雞源樣品中，分別檢測到攜帶armA、rmtC和rmtD基因的沙門菌，檢出率分別為1.43%、0.65%和0.19%［10-13］。本研究的armA基因檢出率高于美國和我國雞源、鴨源樣品的檢出率，高于阿爾及利亞臨床樣品的檢出率；rmtB基因的檢出率高于非洲食品源的檢出率，armA基因與rmtB基因的檢出率均高于其他地區(qū)，可能與樣品量有關(guān)。

本研究調(diào)查了143株不同雞源和鴨源沙門菌，在雞源（23/97，1.99%）和鴨源（1/113，0.94%）中均檢測到。PCR檢測結(jié)果顯示，armA基因在沙門菌中更流行，這與Wang等的研究結(jié)果［12］一致，但與Fang等的研究［11］相反，他們主要檢測出rmtB基因；據(jù)研究報道，其主要從臨床樣品中分離，在動物源性食品源和畜禽源中較少但也有報道。本研究在這些來源中也檢測到，不過與之前研究不同的是本研究主要是從禽類樣品中檢測到，與印度洋研究者及我國研究者的結(jié)論一致。

23株armA/rmtB陽性菌均為印第安納沙門菌，與我國Fang等和Wang等的研究［11-12］類似，提示印第安納沙門菌可能是優(yōu)勢血清型。有意思的是，本研究中印第安納沙門菌主要攜帶armA基因，而Fang等則發(fā)現(xiàn)印第安納沙門菌主要攜帶rmtB基因［11］。

據(jù)報道，16S rRNA甲基化酶僅對4，6-二脫氧鏈霉胺類高度耐藥，而對其他結(jié)構(gòu)的氨基糖苷類藥物相對敏感。本研究結(jié)果表明，23株攜帶armA/rmtB陽性菌均對阿米卡星耐藥，且MIC高達(dá) 512 μg/mL 以上，與之前的文獻(xiàn)報道［14］一致，且表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，這與其他國家地區(qū)的報道［15］一致。Moissssenet等同樣發(fā)現(xiàn)，16S rRNA甲基化酶陽性菌表現(xiàn)出對頭孢菌素類、氨基糖苷類和磺胺類耐藥［16］，Sophiet等也發(fā)現(xiàn)攜帶16S rRNA甲基化酶基因的菌株表現(xiàn)出對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類等耐藥［17］。多重耐藥現(xiàn)象一方面可能與多種抗生素長期廣泛使用有關(guān)，另外也可能是不同藥物對攜帶多種耐藥基因菌株的共選擇。綜上所述，本研究中攜帶16S rRNA甲基化酶基因的陽性菌耐藥性較嚴(yán)重，需要不斷檢測16S rRNA甲基化酶基因的流行情況，也需要合理使用抗菌藥物。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，泰州雞源和鴨源沙門菌以armA基因流行為主，主要來源于雞源的印第安納沙門菌，rmtB基因流行較少；16S rRNA甲基化酶（armA和rmtB基因）是氨基糖苷類藥物高度耐藥的主要原因。

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