鮻耳石鍶標(biāo)記閾值及標(biāo)記效率研究

摘""" 要：為確定鮻耳石鍶標(biāo)記48 h的最低外源添加濃度，以鮻稚魚為研究對象，進(jìn)行不同外源Sr2+質(zhì)量濃度（2.5、5、10、15、20、40、80 mg·L-1）對鮻耳石標(biāo)記效果的研究。結(jié)果表明：添加濃度為20 mg·L-1以上的外源Sr2+，鮻耳石均出現(xiàn)“高鍶標(biāo)記環(huán)”，并且在成活率方面無明顯差異;增加外源Sr2+質(zhì)量濃度，可以提高耳石Sr/Ca值波峰數(shù)值和標(biāo)記環(huán)寬度，但標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)記效率明顯下降。綜上，鮻耳石鍶標(biāo)記具有較強(qiáng)的可行性和安全性，筆者推薦將海水Sr2+濃度提升至20 mg·L-1且標(biāo)記48 h作為優(yōu)化標(biāo)記模式，可有效降低小規(guī)格鮻的大規(guī)模標(biāo)記成本。

關(guān)鍵詞：鮻;耳石;鍶標(biāo)記;閾值;標(biāo)記效率

中圖分類號：S931"""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A""""""""" DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.09.010

收稿日期：2024-05-11

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2023YFD2401103）;天津市海水養(yǎng)殖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ITTMRS2021000-05）

作者簡介：張博倫（1988—），男，天津人，工程師，主要從事海洋牧場、漁業(yè)資源調(diào)查與評估，海水增養(yǎng)殖研究。

通訊作者簡介：王碩（1988—），男，天津人，工程師，主要從事海洋牧場、漁業(yè)資源調(diào)查與評估研究。

Research on Threshold Value of Sr2+ and Efficiency of Different Sr2+ Concentrations during the Period of Strontium Marking in Liza haematocheila

ZHANG Bolun，WANG Shuo，GUO Biao，ZHENG Debin，ZENG Xiangxi

（Tianjin Sea Fisheries Research Institute， Tianjin 300221， China）

Abstract：" In order to determine the lowest Sr2+ added during the strontium of L. haematocheila were marked for 48 h， the juveniles were taken as the experimental material. The marking effects of different external Sr2+ concentrations （2.5，5，10，15，20，40 and 80 mg·L-1） during the strontium Strontium marking of L. haematocheila were studied. The results showed that the \"high strontium marking ring\" was detected in otoliths of fish in all treatments added more than 20 mg·L-1 Sr2+， and no significant difference was observed in survival rate among all treatments. Although the peak value of the Sr/Ca and the width of the marking ring of the otolith were increased with the more exogenous Sr2+ being used， the standardized marking efficiency was significantly decreased. In conclusions， the method of strontium marking on otoliths of L. haematocheila is feasible and safe， the mode of the seawater Sr2+ concentration being increased by 20 mg·L-1 and L. haematocheila being marked for 48 h is suggested as an optimized marking mode， which will reduce cost of large number juveniles being marked.

Key words： Liza haematocheila; otolith; strontium marking; threshold value; marking efficiency

天津農(nóng)業(yè)科學(xué)" Tianjin Agricultural Sciences

2024，30（9）：62-67

基于耳石鈣化結(jié)構(gòu)的新陳代謝惰性[1]，學(xué)者們將耳石作為分析研究魚類生境變遷的重要載體[2]。耳石的大多數(shù)元素與其生存環(huán)境的元素存在一定的正相關(guān)關(guān)系[2-3]。因此，耳石的元素組成能夠很好地反映魚類生存環(huán)境水體的微量元素組成[4-5]。隨著電子微探針技術(shù)的成熟，耳石的微量元素分析可以配合耳石日輪結(jié)構(gòu)，在耳石截面局部區(qū)域進(jìn)行取樣測定，從而分析魚類不同生活階段所處的生活環(huán)境[6-8]。國內(nèi)許多學(xué)者在探究增殖放流生物標(biāo)記技術(shù)的過程中，人為提升魚類生境中鍶離子的濃度，促使高含量鍶在耳石中沉積和永久性保存，并采用耳石微化學(xué)分析技術(shù)對耳石的高鍶標(biāo)記環(huán)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)增殖放流小規(guī)格苗種的大規(guī)模標(biāo)記[9-17]。耳石鍶標(biāo)記技術(shù)有助于科學(xué)、準(zhǔn)確、全面地評估放流效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。

鮻（Liza haematocheila）具有植食性和腐屑食性，其在促進(jìn)增殖水域生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)能量流動、凈化水質(zhì)、維持生態(tài)平衡和優(yōu)化水域環(huán)境具有重要的作用[18]。因此，鮻是我國海洋生物增殖放流的重要種類之一[19]。鮻是天津市所有增殖放流魚類中數(shù)量較多的種類之一，2006—2023年總計(jì)放流8 723.01×104尾。耳石微化學(xué)標(biāo)記技術(shù)可在鮻上應(yīng)用[9-16]，但是不同學(xué)者報(bào)道的標(biāo)記濃度存在差異。郭彪等[14]研究表明，48 h標(biāo)記成功的標(biāo)記濃度為50 mg·L-1。張川等[17]研究表明，24 h標(biāo)記成功的最低濃度為40 mg·L-1、48 h標(biāo)記成功的最低濃度為20 mg·L-1。由此可以看出，鮻的最低標(biāo)記濃度隨著標(biāo)記時間的增加而降低。在實(shí)際應(yīng)用中，降低標(biāo)記成本是鮻耳石微化學(xué)標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用的前提，降低標(biāo)記成本的關(guān)鍵在于最低標(biāo)記濃度以及標(biāo)記海水使用量。鮻苗種培育過程中每天要換水1次[20-21]，標(biāo)記時間不應(yīng)超過48 h，因此標(biāo)記成本取決于最低濃度。張川等[17]研究表明，48 h標(biāo)記成功的最低濃度為20 mg·L-1，但其試驗(yàn)沒有設(shè)計(jì)低于該濃度的處理組，因此48 h鮻耳石鍶標(biāo)記的閾值需要進(jìn)一步探討。為此，本研究通過研究不同Sr2+濃度對鮻耳石的標(biāo)記效果，探討鮻耳石48 h標(biāo)記的Sr2+濃度閾值并分析其標(biāo)記效率，以期為降低鮻耳石鍶的標(biāo)記成本和優(yōu)化鮻耳石微化學(xué)標(biāo)記技術(shù)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用魚的來源及暫養(yǎng)

試驗(yàn)用鮻幼魚體長為（3.0±0.3） cm，體質(zhì)量為（1.03±0.27）" g。試驗(yàn)開始前，鮻幼魚在鹽度為22.5±1.4、水溫為（21.7±0.6）℃、pH值為7.92±0.21的自然海水中暫養(yǎng)1周，每天投喂配合飼料3 次，日總投喂量約為魚體質(zhì)量的2%，日換水量不超過10%。

1.2 標(biāo)記方法

本研究通過向自然海水中添加SrCl2·6H2O來提升海水中Sr2+質(zhì)量濃度，7個標(biāo)記試驗(yàn)組的外源Sr2+質(zhì)量濃度添加量分別為2.5、5、10、15、20、40、80 mg·L-1，并分別命名為2.5 mg組、5 mg組、10 mg組、15 mg組、20 mg組、40 mg組、80 mg組。

挑選健康的幼魚700條，均勻分配到7個處理組，每組設(shè)置5個重復(fù)。每隔6 h統(tǒng)計(jì)各組的幼魚存活率。整個標(biāo)記期間不換水，每天正常投喂3次。標(biāo)記48 h后，分別將每個處理組的幼魚全部轉(zhuǎn)移到盛有600 L自然海水的立方養(yǎng)殖池進(jìn)行后期飼養(yǎng)。飼養(yǎng)21 d后，每個處理組隨機(jī)挑選5尾鮻進(jìn)行耳石微化學(xué)分析。

1.3 耳石微化學(xué)檢測方法

耳石樣品采集、樣品前處理、EPMA分析采用郭彪等[8]研究方法。具體操作如下：取出矢耳石并剔除有機(jī)質(zhì)， 分別用去離子水、無水乙醇清洗，清洗后干燥備用;將耳石用Epofix 環(huán)氧樹脂固定包埋，并在38 ℃條件下烘干12 h以上;采用AB 膠將包埋塊粘貼于載玻片上，凝固2 h后，進(jìn)行切割碾磨并拋光至耳石表面無明顯劃痕;將完成拋光的樣品放入Milli-Q 水中超聲清洗5 min ， 自然條件下晾干24 h， 隨后使用真空鍍膜機(jī)蒸鍍碳膜;利用X 射線電子探針微區(qū)分析儀（JXA-8100型EPMA， 日本電子株式會社）從耳石核心沿耳石最長徑至耳石邊緣呈直線進(jìn)行耳石鍶元素定量線分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為比較不同外源Sr2+質(zhì)量濃度對鮻的標(biāo)記效率，筆者采用公式將不同濃度組標(biāo)記效率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，公式如下：

Eij=（Dij×Nmin）/（Ni×Dmin）

式中，i表示不同標(biāo)記濃度組; j表示某一標(biāo)記濃度下不同重復(fù)單元;Eij表示不同標(biāo)記濃度組不同重復(fù)單元標(biāo)記效率;Dij表示某一指標(biāo)參數(shù)值;Nmin表示最低成功標(biāo)記濃度;Ni表示不同標(biāo)記濃度組標(biāo)記濃度;Dmin表示最低成功標(biāo)記組某一指標(biāo)參數(shù)均值。

本研究采用 Excel 2010軟件和 Spss19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素（One-way ANOVA））進(jìn)行方差分析或χ2檢驗(yàn)，利用 Excel 2010軟件和SigmaPlot 1.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記2 d與標(biāo)記后養(yǎng)殖21 d鮻的存活情況

標(biāo)記2 d，各處理組均未發(fā)生鮻死亡的情況。標(biāo)記后養(yǎng)殖21 d，各組的死亡率范圍為1%～4%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2值為0.878，Pgt;0.05。標(biāo)記2 d和標(biāo)記后養(yǎng)殖21 d，各組的存活率沒有顯著差異（表1）。

2.2 不同標(biāo)記濃度處理組的鍶元素面分布情況

由圖1可知，2.5 mg組、5 mg組、10 mg組的鮻耳石均未出現(xiàn)明顯的“高鍶標(biāo)記環(huán)”，15 mg組僅有1尾鮻耳石出現(xiàn)明顯的“高鍶標(biāo)記環(huán)”，20 mg組、40 mg組、80 mg組的鮻均出現(xiàn)明顯的“高鍶標(biāo)記環(huán)”。

2.3 不同標(biāo)記濃度處理組的鍶元素線性分析結(jié)果

由圖2可知，2.5 mg組、5 mg組、10 mg組的鮻耳石Sr/Ca 比值呈小幅度波動趨勢，但未出現(xiàn)較明顯的增高階段;15 mg組僅有1尾鮻在距核940～960 μm處出現(xiàn)較明顯的增高階段;20 mg、40 mg、80 mg組的鮻均出現(xiàn)增高階段。線性分析結(jié)果表明，海水Sr2+質(zhì)量濃度提升至20 mg·L-1，標(biāo)記時長為48 h，鮻被成功標(biāo)記。

依據(jù)耳石Sr/Ca 比值的整體變化趨勢，本研究以Sr/Ca比值等于9為界，將鮻耳石Sr/Ca 比值的變化分成平穩(wěn)階段和顯著變化階段。其中，2.5 mg組、5 mg組、10 mg組均為平穩(wěn)階段;15 mg組僅有1尾魚出現(xiàn)顯著的變化階段，無法參與統(tǒng)計(jì)分析，將其整體化歸平穩(wěn)階段;20 mg組、40 mg組、80 mg組均可劃分為平穩(wěn)階段和顯著變化階段。不同處理組的單因素方差分析，結(jié)果如表2所示。

7個處理組的平穩(wěn)階段數(shù)值有所波動，但均未出現(xiàn)顯著性差異（Pgt;0.05）。20 mg組的鮻耳石Sr/Ca比值顯著變化階段均值顯著低于40 mg組和80 mg組（Plt;0.05），但40 mg組和80 mg組之間無顯著差異（Pgt;0.05）。20 mg組、40 mg組和80 mg組的鮻耳石Sr/Ca 比峰值均存在顯著差異（Plt;0.05）。其中，20 mg組Sr/Ca 比峰值最低，80 mg組最高。20 mg組的鮻耳石標(biāo)記環(huán)寬度值顯著低于40 mg組和80 mg組（Plt;0.05），但40 mg組和80 mg組之間無顯著差異（Pgt;0.05）。20 mg組、40 mg組和80 mg組的鮻標(biāo)記環(huán)距耳石核心的距離之間沒有顯著差異（Pgt;0.05），標(biāo)記環(huán)的位置距離耳石核心820～1 240 μm。耳石Sr/Ca比值峰區(qū)均值為正常均值倍數(shù)的變化規(guī)律與Sr/Ca比值顯著變化階段均值變化規(guī)律一致。耳石Sr/Ca比峰值為正常均值倍數(shù)的變化規(guī)律與Sr/Ca比峰值的變化規(guī)律一致。

2.4 不同成功標(biāo)記組的標(biāo)記效率

本研究中，20 mg組、40 mg組、80 mg組成功實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，上述3組不同參數(shù)值的標(biāo)記效率分析情況見圖3。由圖3可知，鮻耳石Sr/Ca 比值顯著變化階段均值、峰值、Sr/Ca 比值峰區(qū)均值為正常均值倍數(shù)、Sr/Ca 比峰值為正常均值倍數(shù)4個指標(biāo)效率值在3個處理組之間的變化規(guī)律一致，3個成功標(biāo)記組之間均存在顯著差異（Plt;0.05）。其中20 mg組標(biāo)記不的效率最高，80 mg組最低。80 mg組標(biāo)記環(huán)的效率顯著低于20 mg組和40 mg組（Plt;0.05），20 mg組和40 mg組之間無顯著性差異（Pgt;0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

耳石是一種具有新陳代謝惰性的鈣化結(jié)構(gòu)[1]，耳石的生境元素可永久保存，能很好地記錄魚類生境的變遷[2]。因此，許多學(xué)者通過人為提高增殖魚類苗種階段培育環(huán)境的Sr2+質(zhì)量濃度來實(shí)現(xiàn)小規(guī)格苗種的標(biāo)記[9-17]。本研究中，20 mg組、40 mg組和80 mg組的鮻耳石線性分析均出現(xiàn)1個顯著的上升階段，并且耳石EPMA面分析也出現(xiàn)明顯的“高鍶標(biāo)記環(huán)”。在整個標(biāo)記試驗(yàn)中，標(biāo)記48 h，鮻沒有出現(xiàn)死亡情況，標(biāo)記后養(yǎng)殖21 d，各處理組的鮻存活率基本一致，這與張川等[17]研究結(jié)果一致。這也印證了耳石鍶的標(biāo)記技術(shù)作為小規(guī)格苗種的大規(guī)模標(biāo)記方法具有可行性和安全性。

耳石鍶的標(biāo)記原理是通過人為改變魚類生存水環(huán)境的Sr2+濃度，利用生境元素的永久保存性[2]和EPMA的精確定位性[4]，獲取Sr/Ca值顯著的變化階段和明顯的“高鍶標(biāo)記環(huán)”。這就要求改變后的環(huán)境元素與自然生存條件下的環(huán)境元素有一定的差異度，否則就難以標(biāo)記成功。司飛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，海水的Sr2+質(zhì)量濃度為9.19 mg·L-1，樣品被成功標(biāo)記;Sr2+質(zhì)量濃度為11.16 mg·L-1，部分樣品被成功標(biāo)記;Sr2+質(zhì)量濃度為19.06 mg·L-1，所有樣品被成功標(biāo)記。本研究中，海水的外源Sr2+濃度≥20 mg·L-1時，所有鮻均被成功標(biāo)記;外源Sr2+濃度lt;20 mg·L-1時，只有個別樣品被成功標(biāo)記。因此，標(biāo)記48 h的最低外源Sr2+濃度為20 mg·L-1。

成功標(biāo)記組（20 mg組、40 mg組、80 mg組）的鮻耳石的Sr/Ca值波峰隨著海水添加外源Sr2+濃度的增加而逐漸增高。這說明鮻耳石的Sr/Ca比值與水體的Sr/Ca比值呈正相關(guān)關(guān)系，這與司飛等[4]研究結(jié)果一致。雖然標(biāo)記環(huán)的寬度也是隨著標(biāo)記海水中鍶離子濃度的增加而逐漸增高，但是其變化趨勢與耳石Sr/Ca值波峰有所不同。如果將耳石“高鍶標(biāo)記環(huán)”中的Sr/Ca 峰值、Sr/Ca 顯著變化階段均值、標(biāo)記環(huán)寬度與標(biāo)記濃度的比值分別作為標(biāo)記效率的3個指標(biāo)值，隨著標(biāo)記濃度的增加，3個標(biāo)記效率值均下降，尤其是標(biāo)記環(huán)寬度的標(biāo)記效率值下降最明顯。在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，增加標(biāo)記時間會在一定程度上提高標(biāo)記區(qū)的Sr/Ca 峰值。這說明鮻的最低標(biāo)記濃度值仍然有可能下降[14-15，17]。但在實(shí)際生產(chǎn)中，采用最經(jīng)濟(jì)的方式實(shí)現(xiàn)“高鍶標(biāo)記環(huán)”即可，如果標(biāo)記時長增加，必須要考慮標(biāo)記期間更換海水帶來的成本問題。從標(biāo)記效率和標(biāo)記成本考慮，標(biāo)記時間應(yīng)控制在48 h。

3.2 結(jié)論

綜上所述，耳石鍶標(biāo)記技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小規(guī)格鮻的大規(guī)模標(biāo)記，并且這種標(biāo)記方法是安全可行的。從標(biāo)記效率和標(biāo)記成本考慮，筆者推薦將海水Sr2+濃度提升至20 mg·L-1且標(biāo)記48 h作為優(yōu)化模式。

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